鈦表面納米管結構金納米顆粒加載對成骨細胞MC3T3-E1功能影響的研究

徐博雅 宋文 何奕德 李哲 張玉梅

納米粒子廣泛應用于藥物靶向遞送、分子成像和組織工程等領域，其中金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）由于它們獨特的光電化學特性和良好的生物相容性備受關注［1］。研究表明，AuNPs是非常有吸引力的成骨材料，對骨改建相關的細胞，如成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞及骨髓間充質干細胞的作用顯著［2－3］。因此，將 AuNPs引入牙種植體表面，可能是骨組織工程領域中極具吸引力的材料。

本研究設計并通過電沉積方式在鈦表面納米管上構建尺寸可控的金納米粒子（AuNPs／NTs），評估該表面對MC3T3-E1細胞功能的影響，為鈦種植體表面功能修飾提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

丙酮、無水乙醇、40%氫氟酸、85%磷酸（天津富宇精細化工）；MC3T3-E1細胞系（ATCC，美國）；α-MEM培養基（Gibco，美國）；胎牛血清、青霉素－鏈霉素、胰蛋白酶、CCK-8試劑盒（PCM，美國）；基因引物（北京擎科澤西）；Trizol、逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒（TaKaRa，日本）；BCIP／NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒；茜素紅（Sigma，美國）。

1.2 AuNPs／NTs的構建與表征

陽極氧化制備NTs：直徑為 1.5 cm，厚度為1 mm的圓形鈦片用砂紙進行打磨至表面呈光滑鏡面，作為PT組。在400 mL去離子水中加入23 mL 85%的磷酸溶液和5 mL氫氟酸溶液制備電解液，在10 V電壓下陽極氧化法制備納米管，氧化時間1 h，作為NT組。

電沉積制備 AuNPs／NTs：以 NTs為工作電極，鉑片為輔助電極，極間距 30 mm，在 0.1 mol／L HAuCL4／0.2 mol／L HBO3溶液中以5 V恒電壓沉積，電沉積時間分別設置為5、10、30、60 min。沉積完畢后采用丙酮、無水乙醇、異丙醇、去離子水超聲清洗。

材料表征：采用掃描電鏡SEM對制備完成的試樣進行表面觀察。

1.3 細胞培養

小鼠前體成骨細胞MC3T3-E1使用含10%胎牛血清的α-MEM培養基，添加100 U／mL青霉素和鏈霉素培養。當細胞生長到密度約80%后，采用胰蛋白酶消化傳代、接種試樣。成骨誘導液在生長培養基的基礎上加入 0.108 g／mLβ-甘油磷酸鈉（β-GP），50 μg／mL抗壞血酸（Vc）和 0.2μg／mL地塞米松。

1.4 細胞增殖功能檢測（CCK-8實驗）

將PT、NT和電沉積10 min制備的AuNPs／NTs放置于24孔板內，不含細胞的孔作為空白組，PT和NT作對照組，細胞以1×104／孔的密度接種到試樣表面。每孔加入1 mL的α-MEM，在37℃，5%CO2條件下培養，分別在接種后的第1天、第3天、第5天及第7天進行測定。每孔中更換成500μL含10%CCK-8的培養液繼續培養1 h后，利用酶標儀（Bio-Tek，美國）測定每孔450 nm處的吸光度。

1.5 成骨相關基因檢測（RT-PCR）

細胞接種到不同試樣表面貼壁1 d后更換為成骨誘導液培養3 d，每孔加入200μL Trizol裂解細胞，提取總RNA。利用 Nanodrop 2000（Thermo，美國）測定提取的細胞總RNA的濃度及純度，使用TAKARA的prime script RT試劑盒反向轉錄逆轉錄獲得cDNA模板，CFX96聚合酶鏈反應系統（Bio-rad，USA）進行定量聚合酶鏈反應。實驗使用TB Green?Premix Ex Taq II反應體系，兩步法PCR擴增標準程序（Step 1：95℃變性30 s，Step 2：PCR反應擴增40個循環，Step 3：95℃退火5 s，60℃延伸30 s）。目的基因包括堿性磷酸酶ALP、Runt相關轉錄因子2 Runx2（runt-related transcription factor 2）、骨形態發生蛋白2 BMP-2（bone morphogenetic protein-2）、成骨相關轉錄因子抗體Osterix，骨橋蛋白 OPN（osteopontin）。管家基因選取GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase），其引物序列及各目的基因的引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 RT-PCR primer sequences for RT-PCR

1.6 堿性磷酸酶（ALP）染色

細胞成骨誘導7 d后。采用BCIP／NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒對ALP進行染色，每孔加入染色液200 μL室溫避光孵育過夜。加入去離子水中止染色后，取出材料置于體式顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 細胞外礦化基質染色及半定量分析

細胞成骨誘導14 d后棄去培養液，每孔加入500 μL茜素紅染液，室溫避光孵育5 min，加入去離子水中止染色，體式顯微鏡拍照觀察。隨后向各個孔中加入氯化十六烷基吡啶的洗脫液震蕩30 min洗脫，使用酶標儀測定620 nm處洗脫液的A值并進行比較。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 試樣表面觀察

圖1在為NTs上進行納米金電沉積的SEM圖像以及AuNPs直徑與沉積時間的關系。結果顯示AuNPs大小具有時間依賴性，隨沉積時間延長而生長，且當時間繼續延長至30 min，留存在NTs陣列內的AuNPs受到納米管管徑的限制，尺寸不再發生明顯變化。發現電沉積10 min組的AuNPs／NTs表面金顆粒大小均勻且結構更為穩定，經篩選用于體外細胞實驗，在后續實驗中記錄為AuNPs／NTs組。

圖1 不同沉積時間鈦表面AuNP／NTs陣列的FE-SEM俯視圖和橫截面圖像Fig 1 FE-SEM top and cross-sectional images of AuNP／NTs arrays on titanium surface at different deposition times

2.2 AuNPs／NTs對細胞增殖的影響

如圖2所示，成骨細胞在AuNPs／NTs表面接種培養，其數量隨培養時間延長增殖。與PT組和NT組相比，雖然在培養第5、第7天后AuNPs／NTs表面的成骨細胞數稍有降低，但各時間點A值均未表現出顯著差異（P＞0.05），表明 AuNPs／NTs材料納米管及 Au的加入都不會降低其細胞增殖活性。

圖2 MC3T3-E1細胞在3組樣本表面的增殖活力（CCK-8法）Fig 2 The proliferation viability of MC3T3-E1 cells on the surface of the sample of the 3 groups（CCK-8 assay）

2.3 AuNPs／NTs對細胞成骨基因表達的影響

RT-PCR結果顯示，與PT組相比，AuNPs／NTs組BMP-2表達量明顯增加（圖 3）（P＜0.01），Osterix和OPN與表達量減少（P＜0.05）。與NT組相比AuNPs／NTs組細胞 BMP-2和Osterix的表達上調了1.5倍（P＜0.05），OPN基因的表達上調了 1.2倍（P＜0.01），差異均表現出統計學差異。此外ALP和Runx2基因的表達也有一定上調，但結果未顯示出無統計學差異（P＞0.05）。

圖3 RT-PCR檢測AuNPs／NTs對MC3T3-E1細胞成骨相關基因表達的影響Fig 3 The effect of AuNPs／NTs on osteogenesis-related gene expression in MC3T3-E1 cells

2.4 AuNPs／NTs對細胞成骨向分化的影響

體式顯微鏡下觀察發現各組均見深藍色堿性磷酸酶結晶（圖 4）。與PT組和NT組相比，AuNPs／NTs組可以觀察到更多的深藍色結節。茜素紅溶液染色觀察發現各組均可見深紅色礦化結節（圖 5）。其中AuNPs／NTs組表面顯示出更多的礦化結節，且顏色最深。PT組表面的礦化結節最少。通過對礦化結節洗脫后測定620 nm處吸光度的半定量分析（圖5），顯示AuNPs／NTs組誘導小鼠MC3T3細胞外基質礦化能力最強，且顯著高于PT組和NT組，PT組和NT組間半定量結果無統計學差異。

圖4 不同材料表面MC3T3細胞ALP染色Fig 4 ALP staining of MC3T3 cells on different material surfaces

圖5 不同材料表面MC3T3細胞茜素紅染色及半定量分析Fig 5 Alizarin red staining of MC3T3 cells on the surface of different materials

3 討 論

促進種植體周圍骨組織再生是提高種植體的存活率的關鍵。金納米粒子以其優異的低細胞毒性和高生物相容性廣泛應用于生物診斷、藥物遞送等醫學領域［4－5］。金納米粒子能與成骨細胞相互作用，促進新骨沉積［6］，同時在骨改建的過程中抑制破骨分化［7］。基于這些原因，我們制備了AuNPs功能化的鈦納米管種植體，以促進細胞成骨分化，為增進口腔種植體的骨組織結合提供依據。

AuNPs的制備工藝多樣，目前常用的方法有化學還原方法［8］以及沉積［9－11］、濺射［12］等物理方法，其中電化學還原沉積法技術成熟［13］。基本原理是電解質中的Au3＋在多孔的納米模板表面得到電子還原形成金體。本研究發現隨著沉積時間的延長，位于納米管內的金納米球表現出生長受限，提示納米管狀陣列對金的生長起到一定的空間限制作用。

Zhang等［14］發現20 nm和40 nm的 AuNPs提高人牙周膜祖細胞成骨向分化，促進礦化結節形成；Ko等［15］在不同尺寸中篩選出30 nm和50 nm的AuNPs促進間充質干細胞的成骨分化最為有效。在本研究中，使用了直徑為50 nm的鈦納米管作為電沉積的模板，并在其上合成出平均直徑在30～50 nm的金納米粒子。體外細胞實驗結果表明，AuNPs／NTs可以顯著增加成骨分化特異性標記物如 BMP-2，Osterix和OPN基因的表達。BMP-2是TGF-β超家族中的骨生長調節因子［16］。有研究表明，AuNPs可能作為機械刺激激活 MAPK信號通路，促進 BMP-2／smad／Runx2信號通路的表達進而促進成骨［17－18］。OPN與 Osterix是骨基質的形成所必需的特異性轉錄因子［19］，Osterix可以受到BMP-2通過Dlx5誘導而表達升高［20］。盡管在PCR檢測的早期（3 d）由于時間原因，BMP-2和Runx2表達升高，而ALP的表達未形成顯著累積。但基于7 d的 ALP／AKP染色結果認為，AuNPs／NTs組染色更深代表堿性磷酸酶的活性更高。此外，AuNPs／NTs組顯示出明顯高于其他組的鈣結節沉積。由此可見相比于光滑表面和純納米管表面材料，AuNPs的摻入促進成骨向分化，可用作促進骨整合的牙種植體表面修飾，以改善種植體植入后的骨形成。

本研究在良好的二氧化鈦納米管制備工藝基礎上，探索了電沉積形成AuNPs的相關特征及生物學功效，為鈦種植體表面功能化修飾提供了新的研究方向。此外，本研究尚存在不足之處，對于納米管徑限制AuNPs生長的規律探索不夠清楚，且AuNPs促進成骨分化的機制尚有待進一步的探索。