光交聯粘彈性水凝膠快速恢復損傷膝關節運動的實驗研究

張周陽 劉富偉 辛河 賈雪連 寧小娜 張羽博翰 郭維維 張于凡 李云鵬 孔亮

高強度、頻繁的關節活動常導致關節疲勞，造成關 節損傷，其發生率在軍事訓練中可高達26.4%～35%，在運動員中高達 11%［1－2］。而異常咬合關系、習慣等帶來的不良應力也常造成顳下頜關節損傷及相關疾病［3］。隨著材料科學與組織工程技術的不斷發展，水凝膠材料可降解性、藥物控釋、可控固化等多樣性能，可用于實現關節損傷的再生修復［4］。然而關節組織再生重建緩慢，且具有粘彈性，而非單純彈性形變的獨特承力特點，導致現有水凝膠材料本身或其在機體內改建過程中難以承擔生理運動載荷，是制約水凝膠材料臨床應用的關鍵問題［5］。由此，本研究將以明膠、透明質酸這兩種臨床經典材料為基材，在保有水凝膠再生修復與可控固化優勢前提下，探索賦予材料粘彈性承力特點是否可以快速恢復損傷關節運動，為相關生物材料設計與疾病治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，體重約250 g（第四軍醫大學動物實驗中心），SPF級飼養，自由進食水，12 h晝夜周期節律。實驗前進行跑動適應性訓練，放入滾輪內，維持轉速0.12 m／s，每天分上下午訓練15 min／次，連續5 d后將跑動能力強的8周齡大鼠挑出20只，進行分組和模型制備。

1.1.2 主要試劑與儀器 明膠、甲基丙烯酸酐、光引發劑、透明質酸（上海國藥）；場發射掃描電鏡（Hitachi，日本）；小動物跑輪系統（第四軍醫大學第一附屬醫院骨科）；應變儀與粘度檢測器（西北工業大學理學院）。

1.2 方法

1.2.1 該新型光交聯粘彈性水凝膠（新型水凝膠）構建 將明膠透析純化后加入甲基丙烯酸酐，混合均勻后發生加成反應，隨后加入透明質酸鈉粉末并混入光引發劑以形成交聯網絡，此時在常溫下保持為液態水凝膠。在波長365 nm紫外光（UV）照射2 min后即可固化。

1.2.2 結構表征 光交聯固化后冰凍干燥1 d，抽真空、表面噴金后用掃描電鏡觀察其表面。

1.2.3 粘彈性表征 實驗組：新型水凝膠（具有明膠硬鏈網架結構與透明質酸軟鏈填充）；陰性對照組：單純明膠支架（僅有明膠硬鏈，但網架結構相似）。分別使用應變儀進行彈性模量檢測，使用粘度檢測器進行粘度檢測，以分析新型水凝膠粘彈性特點。

1.2.4 大鼠關節損傷模型構建 實驗組與陰性對照組同上，增加空白對照組（造模但不修復）、商業對照組（臨床用于緩解關節損傷癥狀的經典透明質酸注射劑，間隔1周注射）。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.167 mL／100 g體重），碧藍麻（單側關節 0.1 mL）關節腔注射局部麻醉。為避免健肢代償性運動，采取雙側膝關節造模，進行同分組處理。膝關節周圍脫毛，常規消毒后鋪巾。于膝關節外側切開皮膚并由外向內脫臼髕骨，此時于關節正中切開關節囊，可充分暴露關節軟骨、半月板等結構。在股骨滑車處，用直徑3 mm的環鉆垂直鉆孔深度2 mm，保證足量、持續生理鹽水沖洗降溫，隨后離斷并摘除半月板。注入液態材料后用365 nm波長紫外光照射2 min，確保損傷修復平整處無活動性出血。而后依次縫合關節囊、皮膚，常規飼養。各組于術后1周進行行為學檢測，2月后取材進行組織學檢測。

1.2.5 滾輪運動測試術后1周，待切口愈合后，將各分組大鼠置放于小動物跑輪系統內，設置轉速0.12 m／s后，于前方30 cm處放置相機進行拍攝，觀測并記錄大鼠出現抗拒跑動行為的時間，間隔4 h后重復觀測，反復3遍。

1.3 組織學檢測

術后2月取材，取材后用PBS沖洗組織，置于40 g／L多聚甲醛固定36 h備用。采用EDTA脫鈣液常規脫鈣4周，石蠟包埋后沿股骨滑車前后方向連續切片，厚度4μm，常規HE、番紅O染色，顯微鏡觀察。

1.4 統計學分析

數據結果使用Origin 2021統計軟件進行分析、作圖，組間差異比較使用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05，以 P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 新型水凝膠材料性能表征

常溫下該新型水凝膠成液體，具有流動性，材料表面與水平面平行（圖1A），篩選固化參數后，最終確定2 min為單次固化標準時間，此時有效固化深度約為3 mm。在365 nm波長UV照射后，材料表面與容器底部平行（圖1B）。掃描電鏡可見該水凝膠固化后呈現網狀、均勻、多孔樣結構，孔內均勻填塞透明質酸（圖1C）。同時，分別對實驗組和陰性對照組進行粘彈性承力檢測后發現，無論代表材料彈性的儲能模量（圖1D），還是代表材料粘性的損耗模量（圖 1E），實驗組均高于陰性對照組，表明實驗組材料具有粘彈性力學特點。最后，進行材料粘度檢測，以比較材料抗剪切力的性能，發現實驗組的粘度高于對照組（圖1F）。

圖1 光交聯粘彈性水凝膠材料性能表征Fig 1 Characterization of photocross-linked viscoelastic hydrogel

2.2 新型水凝膠對動物損傷關節運動的恢復效果

造模術如圖 2所示。術后動物無感染、無死亡。術后1周進行行為學檢測，2月進行組織學檢測。

圖2 大鼠關節損傷模型建立Fig 2 Establishment of joint injury model in rats

錄像數據分析顯示，空白組大鼠率先停止了跑動，緊扒在滾輪上（圖3），隨后是陰性對照組與商業對照組，姿態從跑動變化為跳動，隨后停下，也緊扒在滾輪上（圖3）。實驗組在持續運動20min后依然能維持跑動姿態，并且在重復3次后均出現同樣的表現（圖3）。進行數據統計后，實驗組的單次極限運動時間遠超過其他對照組（圖3）。

圖3 大鼠運動能力檢測Fig 3 Comparison of motor ability of rats

2.3 新型水凝膠在體轉歸效果

見圖4。HE與番紅O染色觀察發現，空白組關節缺損嚴重，出現斷崖式凹坑，關節軟骨、軟骨下骨結構破壞，缺損區內無軟骨細胞，而被纖維組織覆蓋；陰性對照組也出現斷崖式凹坑，但存在部分結構不良的軟骨組織；商業對照組具有一定的關節修復效果，表面具有一定厚度的軟骨層，依舊軟骨下骨結構不良，整體缺損仍呈凹坑狀；實驗組動物關節面平整，關節軟骨厚度恢復較好，其中分布大量軟骨細胞，組織結構邊界清晰，基本實現關節損傷區的再生與改建。

圖4 缺損區組織學染色觀察 （×250）Fig 4 The histological observation of the defect area （×250）

3 討 論

關節的承力功能和組織結構，與所受力學載荷大小、周期、角度等參數息息相關［6］。在軍事活動中，空降兵在跳傘落地時，關節常受到地面的直接沖擊或與裝備發生撞擊，其中顳下頜關節損傷及膝關節軟骨缺損是較嚴重表現。更有文獻指出，在某部傷殘軍人中，骨與關節損傷占比高達70.61%，嚴重影響我軍戰斗力［7］。

恢復損傷關節運動是臨床治療核心。關節腔內注射透明質酸是緩解關節損傷癥狀的經典方案。然而癥狀雖緩解但損傷依舊會不斷加重［8］。自體軟骨是修復材料中的金標準，但來源局限、適應癥窄，臨床應用局限［9］。異體或異種軟骨目前仍未能根本上解決存儲、脫敏等核心工藝，應用較少［10－11］。近年來學者們開發多種新型材料以期實現損傷關節的再生修復，形成類天然組織，以恢復生理運動狀態［12］。然而目前相關研究主要集中于提升材料生物活性，對生理運動中的力學性能卻關注不足［13］。這導致大量生物材料缺乏生物力學設計，材料本身或修復改建過程中難以承擔生理運動載荷［14］。近年來有學者提出，關節尤其是表面軟骨組織具有粘彈性承力特性，而非傳統理解上的單純彈性形變，賦予材料適當粘彈性將進一步促進組織再生［15］。

由此，本實驗構建了一種新型水凝膠，在保有水凝膠材料再生修復與可控固化優勢條件下，進一步賦予材料粘彈性承力特點。實驗證實該新型水凝膠可快速恢復大鼠損傷關節運動功能，使術后初始運動時間由6周后可做簡單活動，提升到1周可跑動，效果遠超非粘彈性材料與現有臨床使用的透明質酸注射治療。該新型材料的構建方法一定程度上模擬了天然軟骨中II型膠原與蛋白聚糖間的作用關系。同時，本研究也希望利用兩種材料體內代謝速度差異，維持修復區域力學性能穩定。最后，由于關節損傷個體差異大，本研究借鑒光固化樹脂修復牙齒缺損思路，使其經2 min照射即可具有穩定結構，并可滿足分層固化要求，未來有望在關節鏡等技術輔助下實現相關疾病的微創治療。以上設計理念及實驗結果共同表明，力學性能應納入關節修復材料設計，對快速恢復損傷關節功能意義重大。