三維條件下高糖對牙周膜干細胞成骨成脂分化潛能的影響

張怡林 安瑩 陳發明

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一種來源于牙周膜組織的間充質干細胞，具有良好的增殖和多向分化潛能，并且表達間充質干細胞的表面標記物，被認為是牙周組織再生的種子細胞［1－2］。然而研究表明，糖尿病患者的高血糖微環境可損害干細胞性能，進而阻礙糖尿病患者的組織再生進程。有研究發現，糖尿病小鼠來源骨髓間充質干細的增殖能力下降、凋亡水平升高［3－4］；另一方面，體外高糖環境培養的干細胞也表現出成骨分化潛能減弱［5－6］。因此，高糖環境下 PDLSCs的多向分化潛能受損，可能是糖尿病患者牙周組織再生困難的關鍵原因。

細胞生活的體內環境中具有廣泛的細胞－細胞以及細胞－細胞外基質的相互作用，調控著細胞的生長及代謝活動［7］。但在傳統的體外二維培養條件下，這些相互作用顯著減少，進而引起細胞的形態、生物學行為等發生改變，與細胞在體內的真實狀態存在明顯差別［8］。因此，構建合適的體外培養條件以模擬細胞生活的體內微環境，是研究高糖環境下PDLSCs生物學行為和性能變化的重要基礎。本實驗以PDLSCs為研究對象，利用明膠和谷氨酰胺轉移酶材料構建體外三維培養條件，觀察高糖環境對PDLSCs成骨和成脂分化潛能的影響，以期深入探討基于PDLSCs的干細胞療法在糖尿病患者牙周組織再生中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胎牛血清、高糖DMEM培養基、低糖DMEM培養基（Gibco公司，美國）；ALP染料、ALP活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；茜素紅染料、油紅O染料、阿利辛藍染料（Sigma公司，美國）；明膠、谷氨酰胺轉移酶（北京唯輝生物有限公司）。Real Time PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人PDLSCs的分離培養 收集新鮮拔除的第三磨牙或者因其他原因拔除的牙齒，沿著牙根小心沖洗血跡，去除牙石和牙齦組織。將牙周膜刮下，剪成小塊（約1mm×1mm×1mm），用膠原酶消化45min后離心，用低糖DMEM培養基重懸組織塊并轉移到六孔板中，于37℃、5%CO2條件下培養，每兩天更換培養基。選擇長勢良好的3～5代細胞進行后續實驗。

1.2.2 三維培養條件的構建 根據材料的使用說明書，首先將明膠置于55℃水浴鍋中預熱約5 min至明膠呈液態，在超凈工作臺上靜置5 min至室溫，然后向谷氨酰胺轉移酶粉末中加入100μL無菌ddH2O。使用胰酶消化細胞，細胞計數后將2×105個細胞轉移到無菌的1.5 mL離心管中，離心沉淀細胞后棄去培養基，按照2×106個細胞／mL膠加入100μL明膠后重懸細胞，然后按照明膠：谷氨酰胺轉移酶＝20∶1的比例加入5μL谷氨酰胺轉移酶。吹打混合后將20μL混合液接種到24孔培養板（對于鬼筆環肽染色，將20 μL混合液接種于共聚焦小皿）中，將培養板置于孵箱中進行交聯反應約45 min。待膠凝固后，向每個培養孔中加入2 mL完全培養基。2～3 d更換一次培養基。

1.2.3 鬼筆環肽染色 細胞在三維培養條件中培養48 h后棄去培養基，用4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min。然后使用0.5%的Trixon 100溶液透析細胞15 min，用PBS溶液清洗，加入鬼筆環肽染液對細胞骨架進行染色30 min，再次用PBS溶液清洗。然后加入DAPI溶液對細胞核進行染色15min，使用共聚焦顯微鏡觀察細胞的伸展情況。

1.2.4 成骨和成脂誘導 細胞在三維培養條件中培養，待細胞融合至60%～70%后換成相應的成骨或者成脂誘導液。對照組（CON組）誘導液的葡萄糖濃度為5.5 mmol／L，高糖處理組（HG組）誘導液的葡萄糖濃度為 25 mmol／L（糖濃度參考文獻［4，9－10］）。成骨或成脂誘導液每2 d更換一次。

1.2.5 ALP染色和活性檢測 成骨誘導第7天，收集培養基，用PBS清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定細胞30min，然后用ALP染料染色15～30min，鏡下拍攝照片。將收集的培養基離心5 min，取上清進行ALP活性檢測。

1.2.6 茜素紅染色和礦化結節定量 成骨誘導第21天，棄去培養基，用PBS清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min，然后用茜素紅染料染色5～10 min，鏡下拍攝照片。用10%十六烷基吡啶溶解礦化結節，在560 nm處檢測其吸光度值，進行礦化結節定量。

1.2.7 油紅O染色和脂滴定量 成脂誘導第21天，棄去培養基，用PBS清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定細胞30min，然后使用油紅O染料染色15～30min，鏡下拍攝照片。用異丙醇溶解脂滴，在560 nm處檢測其吸光度值，進行脂滴定量。

1.2.8 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測 使用TRIzol裂解細胞并提取RNA后，使用逆轉錄試劑將提取的RNA逆轉錄成cDNA，對所得的cDNA進行聚合酶鏈式反應。成骨和成脂相關引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3 統計學分析

所有的實驗數據都至少包括3個生物學重復，每個生物學重復包括3次技術重復。數據采用Graphpad Prism 8軟件進行統計，用±s表示。采用獨立樣本t檢驗對兩組間差異進行比較，P＜0.05則認為有統計學差異。

2 結 果

2.1 人PDLSCs培養與鑒定

人PDLSCs培養14 d后，經甲苯胺藍染色可見藍紫色的細胞集落（圖1）；CCK-8檢測結果顯示這些細胞具有體外增殖能力（圖1）。經成骨、成脂或成軟骨誘導后，茜素紅染色可見紅色的礦化結節、油紅O染色可見紅色的脂滴、阿利辛藍染色可見藍色的成軟骨細胞（圖2）。流式細胞術結果顯示這些PDLSCs高表達間充質干細胞表面標記物（CD105、CD146），低表達CD31、CD34、CD45（圖 2）。

圖1 PDLSCs的克隆形成實驗和CCK-8實驗Fig 1 Colony forming assay and CCK-8 assay of PDLSCs

圖2 PDLSCs的多向分化潛能和免疫表型Fig 2 The multi-lineage differentiation potential and immunophenotypes of PDLSCs

2.2 三維培養條件下PDLSCs的形態

倒置顯微鏡可見，三維培養條件下PDLSCs呈圓形分層排列（圖3）。鬼筆環肽染色結果顯示，三維培養條件下細胞呈圓球形，細胞膜緊密地圍繞在細胞核的周圍（圖 3）。

圖3 三維培養條件下PDLSCs的形態特點 （×200）Fig 3 The morphological feature of PDLSCs under 3D culture （×200）

2.3 三維培養條件下高糖環境對PDLSCs成骨分化的影響

與CON組相比，HG組ALP陽性細胞減少、細胞的 ALP活性降低（P＜0.001）（圖 4）；形成的礦化結節數量減少（P＜0.001）（圖 4）。qRT-PCR結果顯示，HG組 PDLSCs中成骨相關基因 RUNX2（P＜0.05）、BMP2（P＜0.05）和 OCN（P＜0.01）表達顯著降低，Col-1表達有所降低，但未見統計學差異（圖4）。

圖4 三維培養條件下高糖環境對PDLSCs成骨分化的影響Fig 4 The effects of high glucose on the osteogenic differentiation of PDLSCs under 3D culture

2.4 三維培養條件下高糖環境對PDLSCs成脂分化的影響

油紅O染色和脂滴定量的結果顯示，與CON組相比，HG組 PDLSCs形成的脂滴增加（P＜0.01）（圖 5）。qRT-PCR結果顯示，HG組PDLSCs中成脂相關基因Adiponectin表達顯著升高（P＜0.01），PPARG表達有所升高，但未見統計學差異（圖5）。

圖5 三維培養條件下高糖環境對PDLSCs成脂分化的影響Fig 5 The effects of high glucose on the adipogenic differentiation of PDLSCs under 3D culture

3 討 論

人體內的細胞生活在三維立體的環境中，細胞與相鄰細胞之間、細胞與細胞外基質之間密切接觸、相互影響，共同調控著細胞的生命活動［11－12］。目前研究者們通常使用二維培養條件來進行體外細胞研究，這種平面培養條件與細胞生活的體內微環境存在明顯差別，可能造成細胞生長狀態的差異［13］。本實驗借助明膠材料和谷氨酰胺轉移酶來構建體外三維細胞培養條件，以更好地模擬體內細胞生活的微環境；本研究發現，三維培養條件下PDLSCs呈分層排列、沒有向周圍形成的突起，且細胞膜緊密地圍繞在細胞核周圍。三維條件下細胞的這種形態特征與其在二維條件下呈單層排列并向四周伸出突起樣結構的形態存在明顯差異［8］。有研究發現，三維培養條件下細胞高度聚縮的形貌有利于降低其對外界不利刺激的敏感度，提高細胞的存活率，更接近細胞在體內的狀態［12］；一些研究也發現，三維支架材料中培養的脂肪間充質干細胞緊縮成圓球形，體積減小，其成軟骨分化潛能也明顯增強［14］。與之前的研究相似，本實驗的結果表明體外三維條件下細胞的形態和伸展情況與傳統的二維條件下存在明顯差異，這些變化在一定程度上可能影響細胞的生物學行為及其對外界刺激的反應。因此，構建合適的體外培養條件以模擬體內微環境，是探索高糖環境對細胞多向分化性能影響的重要基礎。

良好的成骨分化潛能是牙周膜干細胞應用于牙周組織再生的關鍵。另外大量研究表明，高血糖微環境是糖尿病引起細胞性能受損的關鍵因素［15］。因此，本實驗在三維培養條件的基礎上，通過構建體外高糖環境，進一步探索三維培養條件下高糖環境對PDLSCs成骨和成脂分化潛能的影響。結果顯示，高糖環境下細胞形成的礦化結節數量減少、成骨相關基因的表達降低，表明高糖環境下PDLSCs的成骨分化減弱；另一方面，高糖環境下PDLSCs形成的脂滴增加、成脂相關基因的表達升高，表明高糖環境下PDLSCs的成脂分化增強。和本研究的結果相似，有研究發現體外高糖環境下培養的干細胞表現出增殖和成骨分化潛能受損［16－17］，而成脂分化潛能增強［18］；但也有一些研究發現，高糖環境可促進小鼠成骨前體細胞的成骨分化［19］。本實驗通過構建體外三維培養條件，發現高糖環境可抑制PDLSCs的成骨分化并促進其成脂分化，這些結果有望進一步揭示高糖環境對干細胞性能的損害。

本實驗初步發現在體外三維培養條件下細胞的形態特征與傳統二維培養條件下具有顯著差異。進一步證實在體外三維培養條件下高糖環境可抑制PDLSCs的成骨分化，而促進其成脂分化，提示PDLSCs應用于糖尿病人群牙周組織再生可能面臨的風險。采用合適的策略和手段抵抗高糖環境對PDLSCs成骨分化潛能的損害，是糖尿病人群牙周組織再生的關鍵。此外，有研究發現，高糖環境下細胞的 AMPK、Wnt／β-catenin等通路發生改變［20－21］。因此，關于高糖環境影響細胞性能的作用機制還有待深入研究，以期為糖尿病人群牙周組織再生策略的制訂提供參考。