PERK-ATF4通路對增齡相關牙周膜干細胞成骨分化減弱的機制研究

張曦戈 費棟棟 王埡錚 張楊 王曉雨 葛曉彤 王勤濤

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）是從牙周組織分離的成體干細胞，具有增殖，自我更新以及多向分化等特性，在牙周組織再生領域具有廣闊的應用前景［1－2］。成骨分化潛能是PDLSCs重要特性，然而，大量研究表明，老年個體來源的牙周膜干細胞（PDLSCs from the old，O-PDLSCs）成骨分化潛能顯著降低，并已成為老年人牙槽骨骨質疏松的重要因素［3－7］。因此，對于增齡相關 PDLSCs成骨分化能力減弱的機制研究具有重要意義。

未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）是一種細胞維持蛋白質穩態的適應性反應。UPR主要由三個跨膜蛋白啟動：蛋白激酶R樣內質網激酶（protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase，PERK），肌醇需要酶 1（inositol requiring enzyme 1，IRE1）和轉錄活化因子6（activating transcription factor-6，ATF6），UPR通過減少蛋白合成，上調分子伴侶的表達和促進錯誤折疊蛋白質的降解以恢復蛋白質穩態［8］。PERK-轉錄活化因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）通路是UPR的經典通路之一，主要通過抑制蛋白質翻譯以減輕內質網負荷［9］。有研究表明，衰老因素可影響PERK-ATF4通路，導致細胞功能改變［10－11］。此外，也有研究證實 PERK-ATF4通路對間充質干細胞的成骨分化具有重要調控作用［12－14］。但PERK-ATF4通路是否參與增齡相關PDLSCs成骨分化能力降低目前尚不可知。本實驗擬探究PERKATF4通路對增齡性PDLSCs成骨分化能力的調控作用，以期為老年患者的牙周組織修復提供新思路。

1 材料與方法

本項研究經第四軍醫大學口腔醫院倫理委員會的批準（批號：IRB-YJ-2018066），所有受試者均簽署了知情同意書。

1.1 主要材料與儀器

α-最低必須培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；青霉素鏈霉素、胰蛋白酶、茜素紅染色液（北京索萊寶公司）；Ⅰ型膠原酶（Bio-Froxx，德國）；PERK基因過表達質粒（上海吉凱基因）；PERK siRNA（Santa Cruz Biotechnology，美國）；總RNA提取試劑 Trizol Reagent（Invitrogen，美國）；cDNA反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（TaKaRa，日本）；YJ-875型超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）；實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 PDLSCs的分離培養

Y-PDLSCs來源于15～30歲患者健康的第三磨牙及因正畸需要拔除的健康前磨牙，O-PDLSCs來源于55～75歲牙周無明顯炎癥的牙齒，所有患者均無系統性疾病，刮取離體牙牙根中1／3牙周膜，使用Ⅰ型膠原酶于37℃消化40～60 min，每間隔10 min震蕩1次，組織碎片加入完全α-MEM培養基重懸，接種于六孔板中，在含5%CO2的37℃恒溫孵箱中孵育。實驗過程中使用第3～4代PDLSCs。

1.3 siRNA敲減PERK表達

將O-PDLSCs接種至六孔板，待細胞匯合90%～95%時轉染，轉染前2 h對細胞換液，加入1.5 mL無雙抗無血清α-MEM培養基；將轉染復合物和siRNA混合物混勻，室溫靜置20 min，500μL轉染混合物加入六孔板中搖勻，置于37℃恒溫細胞培養箱中，4～6 h更換α-MEM完全培養基。

1.4 PERK過表達

將Y-PDLSCs接種至六孔板，待細胞匯合90%～95%時轉染，轉染前2 h對細胞換液，加入1.5 mL無雙抗無血清α-MEM培養基；將轉染復合物和質粒復合物混勻，室溫靜置20 min，500μL轉染混合物加入6孔板中搖勻，置于37℃恒溫細胞培養箱中，4～6 h更換α-MEM完全培養基。

1.5 PDLSCs的成骨誘導

PDLSCs接種至6孔板中，待細胞匯合至80%時加入成骨誘導培養基（含10 mmol／Lβ-甘油磷酸鈉、0.1μmol／L地塞米松、50mg／L維生素C、10%胎牛血清）。

1.6 茜素紅染色

成骨誘導28 d后，棄培養基，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗2遍，加入茜素紅染液染色20 min，PBS沖洗2遍，置于鏡下觀察，每孔加入1 mL十六烷基吡啶，室溫放置15min，酶聯免疫檢測儀檢測540 nm波長的吸光度值。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）

Trizol提取PDLSCs總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA濃度及純度，配比 20μL反轉錄體系（1000 ngRNA，4μL反轉錄預混液、ddH2O配平），反轉錄cDNA；配比10μL反應體系（1μL的 cDNA、0.4μL目的基因上下游引物、5μL的 SYBR、3.2μL的ddH2O），以GAPDH為內參。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 Y-PDLSCs和O-PDLSCs的成骨分化能力比較

成骨誘導7 d后，采用qRT-PCR檢測成骨相關基因ALPL、RUNX2、OCN的mRNA表達水平，結果顯示，與Y-PDLSCs相比，O-PDLSCs的成骨相關基因的mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05）（圖 1A）。成骨誘導28 d后，茜素紅染色結果顯示，O-PDLSCs的礦化能力顯著降低（圖1B）。以上結果均表明，與YPDLSCs相比，O-PDLSCs的成骨分化能力降低。

圖1 Y-PDLSCs和O-PDLSCs的成骨分化能力比較Fig 1 Comparison of the osteogenic differentiation ability between Y-PDLSCs and O-PDLSCs

2.2 Y-PDLSCs和O-PDLSCs中PERK-ATF4通路相關基因的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，與Y-PDLSCs相比，OPDLSCs的PERK通路相關基因GRP78、CHOP、PERK以及ATF4 mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 PDLSCs中PERK通路相關基因的表達Fig 2 The expression of PERK pathway related genes of PDLSCs

2.3 抑制PERK-ATF4通路對O-PDLSCs成骨分化能力的影響

PERK siRNA轉染O-PDLSCs后，qRT-PCR檢測結果顯示，PERK siRNA轉染后，O-PDLSCs的PERK及PERK通路下游分子ATF4的mRNA表達水平均下降（P＜0.05）（圖 3A）。PERK siRNA可有效抑制O-PDLSCs的PERK-ATF4通路。

PERK siRNA轉染O-PDLSCs后，進行成骨誘導。成骨誘導7 d后，qRT-PCR結果顯示，抑制O-PDLSCs的PERK-ATF4通路后，成骨相關基因ALPL、RUNX2、OCN表達水平均升高（P＜0.05）（圖 3B）。成骨誘導28 d后，茜素紅染色結果顯示，抑制 O-PDLSCs的PERK-ATF4通路后，礦化結節形成數量明顯增加（P＜0.05）（圖 3C）。以上結果均表明，抑制 PERK-ATF4通路后，O-PDLSCs的成骨分化能力升高。

圖3 敲低PERK對O-PDLSCs成骨能力的影響Fig 3 The effects of knockdown of PERK on the osteogenic ability of O-PDLSCs

2.4 激活PERK-ATF4通路對Y-PDLSCs成骨分化能力的影響

用PERK過表達質粒轉染 Y-PDLSCs后，qRTPCR結果顯示，Y-PDLSCs的PERK及ATF4的表達水平均明顯升高（P＜0.05）（圖 4A）。PERK過表達質粒可顯著激活Y-PDLSCs的PERK-ATF4通路。

PERK過表達質粒轉染Y-PDLSCs后，進行成骨誘導。成骨誘導7 d后，qRT-PCR結果顯示，激活YPDLSCs的PERK-ATF4通路后，成骨相關基因的mRNA表達水平均明顯下降（P＜0.001）（圖 4B）。成骨誘導28 d后，茜素紅染色結果顯示，激活Y-PDLSCs的PERK-ATF4通路后，礦化結節形成數量減少（P＜0.05）（圖 4C）。以上結果均表明，激活 PERK-ATF4通路可降低Y-PDLSCs的成骨分化能力。

圖4 過表達PERK對Y-PDLSCs成骨能力的影響Fig 4 The effects of overexpression of PERK on the osteogenic ability of Y-PDLSCs

3 討 論

PDLSCs因其具有自我更新及多向分化潛能等特性，為牙周再生治療提供了可靠來源。而增齡性因素對PDLSCs成骨分化的負向調控限制了其臨床應用，并且是老年人牙槽骨骨質疏松的重要因素。有研究報道，不同年齡受試者PDLSCs的成骨能力隨著年齡的增長顯著降低［3］。本研究發現，相比于Y-PDLSCs，OPDLSCs的成骨相關分子ALPL、RUNX2、OCN在基因水平表達均降低，茜素紅染色結果也證實O-PDLSCs的成骨能力顯著降低。內質網應激 （endoplasmic reticulum stress，ERS）是指各種原因擾動細胞內穩態，使未折疊或錯誤折疊蛋白質在內質網腔內積累。UPR可減少細胞內未折疊或錯誤折疊蛋白的積累以減輕內質網應激［8］。內質網應激被認為是衰老的標志之一，參與了不同組織的衰老［15－17］。PERK-ATF4信號通路是 UPR的經典通路之一。在老年大鼠視網膜中，PERK-ATF4信號通路被激活，ATF4、CHOP表達水平升高［18］。此外，PERKATF4通路也參與調控PDLSCs的成骨分化。較高濃度的TNF-α通過激活PERK-ATF4通路減弱PDLSCs的成骨能力［14，19］。在老年小鼠原代骨細胞中，UPR相關分子 ATF4、CHOP表達升高，導致骨形成減少［20］。但PERK-ATF4通路是否參與增齡相關PDLSCs成骨能力降低目前尚不明確。本研究證實O-PDLSCs中PERK-ATF4通路被激活。并在激活或抑制 YPDLSCs，O-PDLSCs中 PERK-ATF4通路后，檢測PDLSCs成骨能力的變化，證實了增齡性PDLSCs通過激活PERK-ATF4通路調控成骨分化能力。相反，也有研究報道，激活 PERK-ATF4通路有助于年輕PDLSCs的成骨分化［12］。另外，循環機械力作用可誘導內質網應激并通過激活PERK-ATF4通路增強PDLSCs的成骨能力［13］。這種差異可能是由于UPR激活程度不同或細胞來源不同以及細胞所處微環境不同導致的，其具體的調控機制需要更全面深入的探索。

綜上，本研究證明了 PERK-ATF4通路在 OPDLSCs中激活并介導了增齡相關PDLSCs成骨能力的降低。本研究不僅為增齡相關PDLSCs成骨分化能力的降低提供了一種新的機制，也為老年患者的牙周再生提供了新思路。