miR-133a-3p靶向BMP9調控人頜骨骨髓間充質干細胞增殖、分化和凋亡的研究

郭瑩葉 高建華 郭永梅 陳劍英

成骨細胞通過分泌骨基質蛋白在骨形成過程中發揮重要作用［1］。近年來，人頜骨骨髓間充質干細胞（human orofacial bone marrow mesenchyml stem cells，hOBMSCs）的成骨分化調控機制已被研究，并可能在干細胞治療由創傷、腫瘤切除和先天性畸形等引起的大面積骨缺損的臨床應用中具有重要潛力［2－3］。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一種短鏈的、進化保守的非編碼RNA，其通過調節靶基因表達參與多種生物學過程調控，如細胞分化、增殖和凋亡等［4］。近年研究表明多種miRNAs在BMSCs成骨分化中發揮重要作用。有研究指出miR-133a-3p可抑制絕經后骨質疏松癥BMSCs成骨分化［5］。本研究通過生物信息學分析發現骨形態發生蛋白9（bone morphogenetic protein 9，BMP9）是miR-133a-3p的潛在靶基因。BMP9是最具成骨能力的BMPs之一，可誘導BMSCs向成骨細胞分化［6］。本研究擬通過揭示 miR-133a-3p靶向調控BMP9在hOBMSCs增殖、成骨分化和凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胚腎細胞HEK-293（上海酶研生物科技有限公司）；低糖DMEM培養基、胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）；本研究所用miRNA抑制物、抑制物陰性對照、小干擾RNA、小干擾RNA陰性對照、miRNA模擬物、模擬物陰性對照、熒光素酶報告基因載體（上海生工生物公司有限公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Fast qPCR Mix（北京天根生化科技有限公司）；兔源細胞周期素D1（CyclinD1）抗體、兔源裂解的半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）抗體、兔源Runt相關轉錄因子2（Runx2）抗體、鼠源骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）抗體、兔源骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體以及山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗、兔源BMP9抗體（Abcam公司，美國）；二甲基亞砜、膜聯蛋白異硫氰酸熒光素／碘化丙啶（Annexin V-FITC／PI）試劑盒、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（上海碧云天生物科技公司）；兔源 p-Smad1／5／8及兔源 Smad1／5／8抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hOBMSCs細胞分離、培養和成骨誘導 本研究經骨碎片提供者知情同意且獲得我院倫理委員會批準。hOBMSCs由無遺傳及系統性疾病的下頜畸形患者接受正頜手術獲得的骨碎片分離培養獲得。原代細胞融合度為80%時，進行消化傳代，取處于對數生長期的第5代細胞進行研究［2］。將hOBMSCs接種于96孔板，當細胞融合約90%，更換成骨誘導液，每隔1 d換液1次，誘導培養7 d。

1.2.2 實驗分組和處理 實驗分組如下：正常培養組（正常培養的 hOBMSCs）、成骨誘導液組（按照 1.2.1方法進行成骨誘導）、anti-miR-con組（轉染anti-miR-con后進行成骨誘導）、anti-miR-133a-3p組（轉染anti-miR-133a-3p后進行成骨誘導）、anti-miR-133a-3p＋si-con組（共轉染anti-miR-133a-3p和si-con后進行成骨誘導）、anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組（共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9后進行成骨誘導）。

1.2.3 RT-qPCR檢測成骨分化過程中miR-133a-3p和BMP9 mRNA的表達 收集成骨誘導7 d的hOBMSCs，采用Trizol法提取hOBMSCs總RNA，以紫外分光光度計測定總RNA的純度。按cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green Fast qPCR Mix說明書進行cDNA合成和熒光定量PCR擴增。引物序列如下：miR-133a-3p上游 5′-TTAAACCATTAAGCGCAGGA-3′，下游 5′-TTAAATCCTTAAGTCATCCATACA-3′；U6 上 游 5′-ACACTCCAGCTGGGTCAAAATCGTGAAGCG-3′，下 游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′；BMP9上游 5′-GCTGCAGAACTGGGAACA-3′，下 游 5′-AACAAGCATCCCCTGGGG-3′；β-actin 上 游 5′-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下 游 5′-CGATGCCGTGCTCGATGGGG-3′。分別以 U6和 β-actin為內源性參照，按照 2－ΔΔCt法計算 miR-133a-3p和 BMP9 mRNA的相對表達量。按照上述方式檢測miR-133a-3p和BMP9表達對Runx2 mRNA、OCN mRNA和OPN mRNA表達的影響。Runx2上游 5′-CGGGTCTCCTTCCAGGAT-3′，下 游 5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′；OCN上 游 5′-GGTGGTGAATAGACTCCGGC-3′，下 游5′-AGCTCGTCACAATTGGGGTT-3′；OPN上游 5′-GCTATCACCTCGGCCGTTGGGG-3′，下 游 5′-CATTGCCTCCTCCCTCCCGGTG-3′。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-133a-3p對BMP9的靶向作用 TargetScan在線分析顯示BMP9是miR-133a-3p下游潛在性功能靶基因之一。為驗證miR-133a-3p1對BMP9的靶向調控作用，將含有miR-133a-3p結合位點的野生型（WT-BMP9）以及含有miR-133a-3p結合位點突變序列的突變型（MUTBMP9）熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC、miR-133a-3p mimics分別共轉染HEK-293細胞，48 h后，嚴格按熒光素酶活性檢測試劑盒的規定測定各組的熒光素酶活性。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖活力 將 hOBMSCs（2×103cells／孔）接種于96孔板，利用脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000按照上述分組進行細胞轉染，轉染72 h時進行成骨誘導。分別于成骨誘導后0、1、3、5、7 d，MTT法測定各孔的吸光度值。

1.2.6 Western blot檢測成骨分化標志蛋白和Smad通路蛋白的表達 將 hOBMSCs（1×105cells／孔）接種于6孔板，按照實驗分組進行轉染，轉染72 h時進行成骨誘導。于成骨誘導后7 d時，收集細胞檢測成骨分化標志蛋白和Smad通路蛋白的表達量：分別用RIPA裂解液及BCA法提取和測定細胞蛋白濃度。制膠、上樣、轉膜、封閉、一、二抗孵育、顯色、采集圖像，檢測目標蛋白的相對表達，β-actin為內參。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 將hOBMSCs（1×105cells／孔）接種于6孔板，按照實驗分組進行轉染，轉染72 h時進行成骨誘導。胰酶消化后，PBS洗滌2次，離心后，收集細胞，用PBS重懸細胞并計數。取105個細胞，加入195μL的Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5μL的PI輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，立即上機檢測。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0進行統計分析，所有實驗均設置3個平行實驗且重復3次，實驗的計量數據，如hOBMSCs中 miR-133a-3p、BMP9 mRNA和 BMP9蛋白表達，均采用±s表示。兩組間比較采用T檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩均數比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hOBMSCs成骨分化過程中 miR-133a-3p和BMP9的表達

RT-qPCR和Western blot檢測hOBMSCs成骨分化過程中miR-133a-3p和BMP9的表達，結果見表 1和圖1，與正常培養組比，成骨誘導液組hOBMSCs中miR-133a-3p的表達顯著降低，BMP9 mRNA和BMP9蛋白的表達升高（P＜0.05）。

表1 成骨誘導液誘導培養后hOBMSCs中miR-133a-3p、BMP9 mRNA和BMP9蛋白表達（±s，n＝9）Tab 1 The expression of miR-133a-3p，BMP9 mRNA and BMP9 protein in osteogenic induction induced hOBMSCs（±s，n＝9）

表1 成骨誘導液誘導培養后hOBMSCs中miR-133a-3p、BMP9 mRNA和BMP9蛋白表達（±s，n＝9）Tab 1 The expression of miR-133a-3p，BMP9 mRNA and BMP9 protein in osteogenic induction induced hOBMSCs（±s，n＝9）

注：與正常培養組比較，① P＜0.05

分 組 miR-133a-3p BMP9 mRNA BMP9蛋白正常培養組 1.02±0.05 0.97±0.08 0.32±0.05成骨誘導液組 0.68±0.04① 3.47±0.21① 0.66±0.07①t值 15.930 33.375 11.857 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 Western blot檢測hOBMSCs中BMP9蛋白表達Fig 1 BMP9 protein expression in hOBMSCs detected by Western blot

2.2 miR-133a-3p靶向BMP9表達

采用targetscan預測miR-133a-3p下游靶基因發現miR-133a-3p與BMP9的3＇-UTR區域存在部分連續結合位點（圖2A）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示（表2），在HEK-293細胞中，與 miR-con組比，miR-133a-3p組可顯著降低WT-BMP9的熒光素酶活性（P＜0.05）；而miR-133a-3p組與miR-NC組比MUT-BMP9熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）；與 anti-miR-con組比，antimiR-133a-3p組可顯著升高WT-BMP9的熒光素酶活性（P＜0.05）；而 anti-miR-133a-3p組與 anti-miR-con組比MUT-BMP94熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）。Western blot和RT-qPCR檢測顯示，與miR-con組比，miR-133a-3p組HEK-293細胞BMP9 mRNA和蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）；與 anti-miR-con組比，antimiR-133a-3p組HEK-293細胞BMP9 mRNA和蛋白的表達顯著升高（P＜0.05）（表 2和圖 2B）。

圖2 Western blot檢測HEK-293細胞中BMP9蛋白表達Fig 2 BMP9 protein expression in HEK-293 cells detected by Western blot

表2 miR-133a-3p對BMP9蛋白表達的調控作用（雙熒光素酶報告實驗）（±s，n＝9）Tab 2 The regulation of miR-133a-3p on BMP9 protein expression（Dual luciferase report assay）（±s，n＝9）

表2 miR-133a-3p對BMP9蛋白表達的調控作用（雙熒光素酶報告實驗）（±s，n＝9）Tab 2 The regulation of miR-133a-3p on BMP9 protein expression（Dual luciferase report assay）（±s，n＝9）

注：①與miR-con組比較，P＜0.05；②與anti-miR-con組比較，P＜0.05

分組 WT-BMP9 MUT-BMP9 BMP9 mRNA BMP9蛋白miR-con 0.96±0.09 1.25±0.09 1.00±0.10 0.42±0.05 miR-133a-3p 0.61±0.07① 1.22±0.13 0.45±0.04 0.21±0.03①anti-miR-con 1.08±0.12 1.21±0.09 1.02±0.09 0.35±0.04 anti-miR-133a-3p 1.63±0.14② 1.24±0.11 1.59±0.13 0.68±0.07②F值 137.209 0.265 213.148 141.212 P值 0.000 0.850 0.000 0.000

2.3 沉默 BMP9部分逆轉干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs的增殖促進作用

采用MTT實驗檢測hOBMSCs增殖，結果見圖 3和表 3，與 anti-miR-con組比，誘導第 3、5、7天時hOBMSCs增殖活力顯著增加（P＜0.05），誘導第 7天時CyclinD1蛋白表達量顯著增加（P＜0.05）；與 antimiR-133a-3p＋si-con組比較，誘導第 3、5、7天時hOBMSCs增殖活力顯著降低（P＜0.05），誘導第 7天時CyclinD1蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。

表3 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs增殖的影響（±s，n＝9）Tab 3 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the proliferation of hOBMSCs（±s，n＝9）

表3 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs增殖的影響（±s，n＝9）Tab 3 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the proliferation of hOBMSCs（±s，n＝9）

注：① 與anti-miR-con組比較，P＜0.05；② 與anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，P＜0.05

分 組CyclinD1 0 d 1 d 3 d 5 d 7 d 7 d A490 anti-miR-con 0.27±0.02 0.31±0.03 0.39±0.03 0.57±0.04 0.74±0.05 0.59±0.05 anti-miR-133a-3p 0.26±0.03 0.33±0.02 0.58±0.04① 0.82±0.05① 1.14±0.07① 0.92±0.09 anti-miR-133a-3p＋si-con 0.28±0.02 0.34±0.03 0.54±0.04 0.79±0.05 1.08±0.07 0.94±0.08 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 0.29±0.03 0.32±0.04 0.45±0.03② 0.69±0.03② 0.82±0.06② 0.64±0.06 F值 2.308 1.579 53.580 99.640 85.962 58.646 P值 0.095 0.214 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 Western blot檢測CyclinD1蛋白表達Fig 3 CyclinD1 protein expression detected by Western blot

2.4 沉默 BMP9部分逆轉干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs的促分化作用

Western blot檢測hOBMSCs分化相關蛋白表達，結果見表 4和圖 4，與 anti-miR-con組比，anti-miR-133a-3p組 hOBMSCs中 BMP9、Runx2、OCN以及 OPN在mRNA和蛋白水平的表達均顯著升高（P＜0.05）；與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比，anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組hOBMSCs中BMP9、Runx2、OCN以及OPN在mRNA和蛋白水平的表達均顯著降低（P＜0.05）。

表4 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中BMP9、Runx2、OCN和OPN蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 4 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of BMP9，Runx2，OCN and OPN protein in hOBMSCs（±s，n＝9）

表4 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中BMP9、Runx2、OCN和OPN蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 4 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of BMP9，Runx2，OCN and OPN protein in hOBMSCs（±s，n＝9）

注：① 與anti-miR-con組比較，P＜0.05；② 與anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，P＜0.05

分 組 BMP9 mRNA Runx2 mRNA OCN mRNA OPNmRNA BMP9蛋白 Runx2蛋白 OCN蛋白 OPN蛋白anti-miR-con 1.00±0.10 1.00±0.11 1.00±0.10 1.00±0.09 0.32±0.04 0.23±0.02 0.25±0.02 0.33±0.03 anti-miR-133a-3p 1.86±0.15① 1.52±0.14① 1.61±0.14① 1.39±0.12① 0.68±0.05① 0.42±0.02① 0.49±0.04① 0.46±0.06①anti-miR-133a-3p＋si-con 1.92±0.16 1.61±0.15 1.57±0.13 1.42±0.13 0.62±0.07 0.43±0.03 0.48±0.03 0.54±0.05 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 1.25±0.11② 1.08±0.09② 1.18±0.11② 1.10±0.09② 0.36±0.04② 0.28±0.04② 0.35±0.02② 0.36±0.04②F值 105.688 54.486 54.676 33.215 111.736 109.818 142.818 38.616 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖 4 Western blot檢測 hOBMSCs中 BMP9、Runx2、OCN和OPN蛋白表達（第7天）Fig 4 The expresion of BMP9，Runx2，OCN and OPN protein in hOBMSCs detected by Western blot（7th day）

2.5 沉默 BMP9部分逆轉干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs的凋亡抑制作用

流式細胞術和Western blot（表 5、圖 5），與 antimiR-con組比，anti-miR-133a-3p組 hOBMSCs的凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）；與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組 hOBMSCs的凋亡率、Cleavedcaspase-3蛋白表達量顯著升高（P＜0.05）。

圖5 沉默BMP9部分逆轉干擾miR-133a-3p對hOBMSCs的凋亡抑制作用Fig 5 The inhibitory effect of interference of miR-133a-3p by silencing BMP9 partially on hOBMSCs apoptosis

表5 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs凋亡的影響（±s，n＝9）Tab 5 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the apoptosis of hOBMSCs（±s，n＝9）

表5 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs凋亡的影響（±s，n＝9）Tab 5 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the apoptosis of hOBMSCs（±s，n＝9）

注：與anti-miR-con組比較，①P＜0.05；與anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，② P＜0.05

分 組 細胞凋亡率（%） Cleaved-caspase-3 anti-miR-con 9.24±0.76 0.72±0.07 anti-miR-133a-3p 3.58±0.34① 0.31±0.03 anti-miR-133a-3p＋si-con 3.14±0.48 0.28±0.02 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 5.83±0.61② 0.65±0.06 F值 216.175 189.796 P值 0.000 0.000

2.6 沉默 BMP9部分逆轉干擾 miR-133a-3p對hOBMSCs中Smad通路的影響

Western blot檢測Smad通路相關蛋白表達，見表6和圖 6，與 anti-miR-con組比，anti-miR-133a-3p組hOBMSCs中 p-Smad1／5／8蛋白的表達顯著升高（P＜0.05）；與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組 hOBMSCs中 p-Smad1／5／8蛋白的表達顯著降低（P＜0.05）。

圖 6 Western blot檢測 hOBMSCs中 p-Smad1／5／8和 Smad1／5／8蛋白表達Fig 6 p-Smad1／5／8 and Smad1／5／8 protein expression in hOBMSCs detected by Western blot

表6 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中p-Smad1／5／8和Smad1／5／8蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 6 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of p-Smad1／5／8 and Smad1／5／8 in hOBMSCs（±s，n＝9）

表6 共轉染anti-miR-133a-3p和si-BMP9對hOBMSCs中p-Smad1／5／8和Smad1／5／8蛋白表達的影響（±s，n＝9）Tab 6 The effect of co-transfection with anti-miR-133a-3p and si-BMP9 on the expression of p-Smad1／5／8 and Smad1／5／8 in hOBMSCs（±s，n＝9）

注：①與 anti-miR-con組比較，P＜0.05；②與 anti-miR-133a-3p＋si-con組比較，P＜0.05

分 組 Smad1／5／8蛋白 p-Smad1／5／8蛋白anti-miR-con 0.66±0.08 0.29±0.02 anti-miR-133a-3p 0.68±0.05 0.62±0.07①anti-miR-133a-3p＋si-con 0.64±0.06 0.61±0.06 anti-miR-133a-3p＋si-BMP9 0.63±0.05 0.41±0.05②F值 1.180 81.553 P值 0.333 0.000

3 討 論

BMSCs成骨分化研究可有效的調控骨損傷疾病的再生和修復，其在組織工程中的應用越來越受到重視［7］。研究發現miR-133a-3p的異常表達還可參與肌源性分化和骨骼肌生長的調控［8］。miR-133a-3p還調控BMSCs的成骨分化，并與BMSCs異常分化引起的人類疾病密切相關［9］。單核細胞中miR-133a表達還可作為臨床絕經后骨質疏松癥輔助診斷指標［10］。本研究發現在誘導hOBMSCs成骨分化過程中miR-133a-3p表達顯著降低，提示miR-133a-3p表達改變可能與hOBMSCs成骨分化相關。功能分析顯示，干擾miR-133a-3p表達顯著增加細胞活力，抑制細胞凋亡。

Runx2是調節BMSCs形態和誘導成骨細胞分化的早期成骨標志物，OCN是BMSCs晚期成骨分化標志物，OPN通過與組織中的輕磷灰石結合在骨基質礦化中發揮作用，三者是檢測BMSCs成骨功能的關鍵指標［11］。本研究表明，干擾miR-133a-3p表達可顯著上調 Runx2、OCN、OPN蛋白表達水平，與 Zhang等［12］抑制miR-133a表達可促進BMSCs成骨分化的結論基本吻合。以上研究說明干擾miR-133a-3p可促進hOBMSCs增殖和成骨分化，抑制細胞凋亡。

BMP9被認為是最具成骨能力的BMPs之一。研究顯示miR-155通過下調BMP信號通路可抑制BMP9誘導的間充質干細胞的成骨分化［13］。黃芪多糖通過下調miR-152增加BMP9表達促進骨間充質干細胞的增殖和成骨分化［14］。本研究發現在誘導hOBMSCs成骨分化過程中BMP9表達顯著升高，并證實miR-133a-3p靶向負性調控BMP9表達。恢復實驗顯示干擾BMP9部分逆轉miR-133a-3p抑制對hOBMSCs增殖、成骨分化和凋亡的影響。Smad信號通路與骨骼發育過程中BMSCs分化相關，BMPs可誘導 Smad1／5／8磷酸化，磷酸化的Smad1／5／8與Smad4結合并轉運至細胞核，進而與組織特異性轉錄因子協同驅動成骨靶基因表達［15］。研究發現包括miRNA在內的多種因子通過激活Smad通路參與調控 BMPs成骨分化［16－17］。本研究發現干擾miR-133a-3p表達抑制hOBMSCs細胞p-Smad1／5／8蛋白表達，而干擾BMP9部分逆轉miR-133a-3p抑制對 p-Smad1／5／8蛋白表達的影響，說明miR-133a-3p通過調控BMP9表達參與hOBMSCs的增殖、成骨分化和凋亡，其機制可能與調控Smad通路有關。干擾miR-133a-3p表達有望成為骨損傷相關疾病治療的新途徑。