誘導型一氧化氮合酶在種植體骨結合初期的表達研究

周辰 石晶

1.030001，太原市中心醫院口腔科；2.山西醫科大學附屬人民醫院口腔內科

誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是病理性一氧化氮（nitric oxide，NO）形成的限速酶，脂多糖和多種細胞因子可誘導iNOS在巨噬細胞中產生，并能催化底物持續產生大量的NO使其參與炎癥過程［1－2］。以往研究發現在牙周炎和種植體周圍炎中，iNOS的表達與牙槽骨吸收密切相關［3－4］，且與牙周炎患者相比，種植體周圍炎患者中iNOS陽性表達細胞的密度更高［5］。近期研究中有學者發現，在種植體骨結合過程中iNOS表達始終處于較低水平［6］。經查閱文獻發現，國內外對于種植體骨

結合過程中iNOS的表達研究較少，且現有結果表明，iNOS的表達均參與種植體的骨吸收過程。最新研究中Rajfer等［7］發現，種植體骨結合過程與骨折的愈合過程非常相似，且iNOS表達可通過參與骨成形，對骨折愈合起到促進作用。因此本實驗擬建立大鼠種植體模型，以其為實驗對象，通過免疫組化方法檢測種植體初期愈合過程中iNOS的表達變化，以期初步明確iNOS在種植體骨結合過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 本實驗中選取3～5個月齡清潔級雄性SD大鼠20只。動物許可證號：SYXK（晉）2019－0003，本實驗得到山西省人民醫院倫理委員會批準（省醫科倫審字第68號）。

1.1.2 建立大鼠種植體模型 常規消毒后對大鼠進行腹腔內注射麻醉（2%戊巴比妥溶液，0.3mL／100 g，博士德公司），待麻藥起效后，在大鼠右側股骨－脛骨連接處鉆出直徑為2 mm深度為5 mm的骨缺損區，即刻植入純鈦種植釘作為實驗組，同期，在大鼠左側對應部位同法制備相同直徑和深度的骨缺損，作為對照組。

1.2 免疫組化

在不同實驗時間點將標本脫鈣、固定包埋，制備成石蠟切片，最后按照試劑說明書檢測iNOS的表達情況。

2 結 果

iNOS的表達情況見圖1。實驗組和對照組均在術后第4天iNOS表達最多，呈深棕色和棕黃色顆粒（箭頭所指為陽性表達的成纖維細胞），且主要分布在成纖維細胞胞漿中，第7天時iNOS的表達減少，染色為棕色，且在成骨細胞胞漿內出現片狀棕黃色顆粒。實驗組和對照組中iNOS的表達在第14天和第21天時明顯減少，圖中可見部分成骨細胞和骨細胞胞漿內出現棕色顆粒。

圖1 實驗組與對照組iNOS免疫組織化學染色結果（×400）

3 討 論

正常濃度的NO在維護機體的生理狀態中發揮著重要作用，但當外源性因素導致NO濃度過高或者代謝紊亂時則與機體的多種病理狀態密切相關，而iNOS在NO濃度異常或代謝紊亂時均表達異常，又由于NO在機體內的水平很難被檢測，因此，學者們為明確濃度異常的NO在炎癥或者腫瘤等多種病理狀態下的作用，常將iNOS作為研究目標。iNOS在骨折愈合過程中的作用一直存在爭議。Farhad等［8］的研究中發現，在大鼠股骨建立骨缺損模型，8周后組織學和組織形態學分析發現，與安慰劑組和空白對照組相比，選擇性iNOS抑制劑氨基胍（aminoguanidine，AG）組平均骨愈合分數和新生板層骨的百分率均明顯升高，且差異具有統計學意義，上述結果表明iNOS抑制劑可促進局部骨形成。而另有研究者發現，口服COMB-4，其能上調iNOS表達，在42 d后進行結果分析示：COMB-4組骨強度和剛度明顯高于對照組，結果提示iNOS的表達升高能促進骨折愈合［7］。國內外對于種植體骨結合與iNOS的相關關系研究較少。Biguetti等［9］的最新研究發現，通過在小鼠前牙與磨牙的無牙頜區建立種植牙模型，通過實時定量聚合酶鏈式反應檢測發現，iNOS的基因表達水平始終較低，與本實驗結果存在明顯差異，對其差異原因進行分析，可能有如下原因：首先，研究實驗部位選擇不同；Biguetti等選擇的是小鼠頜骨種植模型，為膜內成骨，而本實驗選擇大鼠脛骨為種植部位，而其為通過軟骨內骨化成骨的，因此兩個部位骨愈合的修復方式可能不同，這可能造成結果不同的主要原因。其次，Biguetti等研究檢測的是iNOS的基因水平的表達狀況，而本課題組檢測的是iNOS蛋白水平表達情況，這也是結果不同的可能原因，今后本課題組將繼續在大鼠頜骨內進行基因和蛋白兩個水平上的實驗進行再次驗證。

綜上所述，本實驗結果表明，iNOS蛋白表達在種植體骨結合的早期，且其主要在成骨樣細胞和部分骨細胞中可見，結果表明iNOS的表達對促進骨形成起到促進作用，在成纖維細胞中也可見iNOS的表達，揭示iNOS的表達對促進成纖維細胞的活化，促進種植體骨結合過程中由炎癥期到增殖期起重要的作用。本實驗結果表明iNOS可有效促進骨結合，為提高種植體的成功率且減少種植體周圍炎的產生提供新思路和新策略。