鼻咽拭子細菌培養在兒童細菌性呼吸道感染病原診斷中的價值

謝永平， 華春珍， 魏林琳， 汪洪姣， 王高良， 李建平

（1.浙江大學醫學院附屬兒童醫院感染病科，浙江 杭州 310003；2.浙江大學醫學院附屬兒童醫院實驗檢驗中心，浙江 杭州 310003）

呼吸道感染是臨床常見的疾病之一，以肺炎為代表的下呼吸道感染是造成兒童門診和住院的最常見原因[1]。發展中國家兒童肺炎以細菌感染多見，其中肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）和卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）是全球公認的社區獲得性肺炎三大細菌學病原[1-3]，這些病原菌的確定往往通過氣道分泌物——肺泡灌洗液、肺穿刺液、深部痰液培養協助診斷。肺泡灌洗液、肺穿刺液檢測為創傷性檢查，在兒科臨床不常用；采集兒童痰液比較困難[4]，＜1歲的患兒不能自主咳痰，通過誘導收集的痰液樣本合格率也較低[5-6]，明顯影響肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等呼吸道苛氧菌的檢出率[4-6]。此外，百日咳再現是近年來國內外的熱點問題[7-8]，百日咳的病原——百日咳鮑德特菌（Bordetella pertussis，BP）是上呼吸道病原，鼻咽拭子是培養百日咳鮑德特菌的最理想樣本，而且鼻咽拭子采集很容易規范化操作。本研究通過對類百日咳綜合征和急性肺炎患兒同時進行鼻咽拭子培養和深部誘導口腔吸取物培養，比較2種樣本細菌培養的陽性率和分離菌種，并結合患兒臨床癥狀和治療后細菌培養結果，評價鼻咽拭子培養在兒童細菌性呼吸道感染中的診斷價值，為兒童呼吸道樣本的采集方式選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年1月1日—6月30日浙江大學醫學院附屬兒童醫院某病區疑診為急性肺炎和類百日咳綜合征的患兒。納入標準：（1）年齡＜1歲；（2）符合肺炎診斷標準[9]；（3）類百日咳綜合征患兒具有類似百日咳的臨床表現[10]。排除標準：（1）胃食管反流等影響負壓抽吸誘導痰液患兒；（2）因出牙影響吸痰患兒；（3）近期有鼻腔出血或其他鼻腔問題影響鼻咽拭子采集患兒。本研究獲浙江大學醫學院附屬兒童醫院倫理委員會批準（倫理編號：2016-IRB-014），患兒監護人均知情同意。

1.2 儀器和試劑

英國OXOID 公司CM0119碳瓊脂培養基（生產批號1824403）、選擇性鮑德特菌培養基添加物（每支含頭孢氨芐20.0 mg）；英國Remel Europe公司百日咳鮑德特菌凝集血清（生產批號1508264）和副百日咳鮑德特菌凝集血清（生產批號1751599）；意大利Copan公司無菌藻酸鈣鼻咽拭子。法國生物梅里埃公司含5%羊血的哥倫比亞基礎瓊脂培養皿和嗜血桿菌選擇性培養基（HAE）、VITEK 2 Compact自動化鑒定藥敏儀。德國Bruker公司Microflex LT/SH質譜儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 同時采集患兒入院時鼻咽拭子和口腔吸取物樣本。鼻咽拭子采集時固定患兒頭部及上肢，將拭子貼鼻孔壁，沿垂直于耳垂方向慢慢轉動進入患兒1側鼻孔內，至鼻腭處（深度約為鼻尖至耳垂距離），然后邊擦拭邊旋轉至少3圈，慢慢取出，置于原裝無菌套管內立即送檢。口腔吸取物采集時患兒行0.9%氯化鈉溶液霧化，經口腔負壓抽吸深部口腔吸取物至少5 mL，置于無菌痰杯立即送檢。合格口腔吸取物的標準為涂片鏡檢每低倍鏡視野白細胞＞25個、上皮細胞＜10個[5]。

1.3.2 樣本的接種、培養和鑒定 樣本采集后（包括不合格口腔吸取物）立即分區劃種于含5%羊血的哥倫比亞基礎瓊脂培養皿。嗜血桿菌選擇性培養皿和碳瓊脂培養皿。前兩者置5%CO2孵箱，35 ℃（濕度60%～70%）孵育18～20 h；后者置普通孵箱，35 ℃（濕度60%～70%）孵育7 d。

1.3.3 細菌鑒定 流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的鑒定采用NH卡，肺炎鏈球菌的鑒定采用GPI卡加Optochin試驗。百日咳鮑德特菌的鑒定采用抗血清凝集試驗+質譜分析驗證。百日咳鮑德特菌只要分離到，無論定量多少，均有臨床意義；其他細菌培養結果“+++”及以上考慮有臨床意義[11]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。正態分布計量資料以±s表示，非正態分布資料用中位數（M）[四分位數（P25，P75）]表示。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患兒一般情況

共納入患兒403例，其中男145例（36.0%），年齡（157±97）d；女258例（64%），年齡（158±88）d。有7例（1.7%）患兒合并基礎疾病，其中先天性喉軟骨軟化3例、癲癇2例、腦萎縮和支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）各1例。有303例（75.2%）患兒入院前經β-內酰胺酶類抗菌藥物治療5（3，10）d，31例（7.7%）單用大環內酯類抗菌藥物治療4（3，5）d，69例（17.1%）入院前未經抗菌藥物治療。按照痰液的標準，403份口腔吸取物樣本合格率僅為12.2%（49/403）。

2.2 口腔吸取物和鼻咽拭子培養結果比較

分別有50份（12.4%）口腔吸取物樣本和127份（31.5%）鼻咽拭子樣本樣本分離到致病菌（如百日咳鮑德特菌）或條件致病菌“+++”以上。鼻咽拭子培養總陽性率（χ2=42.92，P＜0.001）和百日咳鮑德特菌（χ2=49.10，P＜0.001）、流感嗜血桿菌（χ2=4.17，P=0.041）、卡他莫拉菌（χ2=7.38，P=0.007）、肺炎鏈球菌（χ2=4.37，P=0.037）的分離率均顯著高于口腔吸取物樣本。62.0%（31/50）的患兒鼻咽拭子細菌培養結果與口腔吸取物細菌培養結果一致。2種樣本細菌培養結果見表1。

表1 403例患兒2種樣本病原培養結果比較

2.3 患兒臨床特點和治療轉歸

鼻咽拭子培養到條件致病菌的127例患兒中，男性患兒69例（54.3%）、女性患兒58例（45.7%）；百日咳患兒54例（42.5%），其中38例合并肺炎；類百日咳綜合征患兒24例（18.9%），其中10例合并肺炎；無百日咳樣咳嗽肺炎患兒49例（38.6%），其中2例合并膿毒癥、1例合并鵝口瘡、1例合并流行性感冒、1例合并血小板減少性紫癜。除5例百日咳患兒癥狀改善不明顯外，其余122例（96.1%）患兒治療后，均治愈或好轉，無并發癥和后遺癥發生。127例恢復期患兒經鼻咽拭子培養復查，病原陰轉率為98.4%（125/127），僅2例百日咳患兒百日咳鮑德特菌持續陽性。

3 討論

人體鼻咽部是一個含大量正常菌群的巨大微生態系統，這些正常菌群通常包括鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、葡萄球菌屬、莫拉菌屬和棒狀桿菌屬，是人體抵御致病菌、條件致病菌的一道重要的微生物屏障[12-13]。肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌為鼻咽部常見條件致病菌，在鼻咽部少量存在時構成正常菌群的一部分，但當某種細菌呈絕對優勢生長時，可引起機體感染。痰液培養在下呼吸道感染病原診斷中的價值一致受到爭議[14]。一般認為，上述細菌在痰液等上呼吸道有菌定植或寄生來源的樣本分區劃種半定量達“+++”及以上時，應考慮感染可能，可界定為陽性[15]。鼻咽部菌群與下呼吸道感染關聯，當鼻咽部某些細菌增多，開始優勢生長時，就可能向下呼吸道移行，引起肺部感染[16]。本研究403份口腔吸取物樣本中僅有12.4%的樣本細菌培養結果陽性，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌這三大社區獲得性肺炎病原菌分離率較低，除與這些苛養菌體外生存能力較弱、對營養要求較高有關外，還與本研究人群為＜1歲患兒有較大關系，從患兒口腔按照吸痰操作吸出的部分吸取物并非真正的痰液，近90%不符合痰液標準，與相關研究結果[6]一致。本研究發現，鼻咽拭子培養條件致病菌半定量達“+++”及以上的分離率顯著高于口腔吸取物培養，尤其是流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和卡他莫拉菌等苛養菌的分離率大幅度提高，且病原菌與臨床感染符合，治療后患兒臨床癥狀改善的同時，這些病原菌在鼻咽部優勢生長的狀態不復存在，提示鼻咽拭子培養的結果對患兒細菌性下呼吸道感染的病原診斷有參考價值。

百日咳是由百日咳鮑德特菌感染引起的急性呼吸道傳染病，近年來在國內外發病率大幅度上升[17-18]，已引起廣泛關注。百日咳鮑德特菌是上呼吸道病原，主要感染部位在鼻咽部，很少侵入下呼吸道引起肺炎，因此鼻咽拭子是監測百日咳鮑德特菌的最佳樣本。本研究由于入組時納入較多類百日咳綜合征患兒，百日咳鮑德特菌分離率最高，也提示百日咳是兒科臨床常見病種[19]。本研究中，口腔吸取物極少培養到百日咳鮑德特菌，符合百日咳的特點。本研究還發現，百日咳患兒合并或繼發流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和肺炎鏈球菌感染的概率較高，其具體機制有待進一步研究。

采集鼻咽拭子作為病毒檢測的樣本應用廣泛，但關于鼻咽拭子培養在下呼吸道感染患兒病原菌診斷中的價值，國內外鮮有報道。鼻咽拭子樣本采集較為簡單，操作過程容易規范，包括進入鼻腔的深度和刷取黏液時拭子旋轉的次數都可數據化界定，可確保不同人員采集的樣本質量都能均質穩定。本研究的不足之處在于研究樣本量不夠大，且僅僅是單中心研究。為更客觀地評價鼻咽拭子培養在兒童呼吸道感染病原診斷中的價值，我們擬建立多中心研究平臺，在細菌培養的同時，采用鼻咽拭子高通量測序分析鼻咽部的菌群類型和各優勢菌屬、菌種的絕對豐度、相對豐度，分析鼻咽拭子分區劃種培養半定量結果與高通量測序菌群豐度之間的定量關系，并與臨床診治結果相關聯，以更好地評價鼻咽拭子培養在兒童呼吸道感染病原診斷中的價值。