CLSI EP06-Ed2文件在定量測量程序線性驗證中的應用

李曉博， 普智飛， 吳曉琪， 劉洋洋， 謝軒波， 單漢明， 于嘉屏

（杭州迪安醫學檢驗中心，浙江 杭州 310030）

在給定的測量區間內，當測定結果與樣本中被測物真實的量值成比例時，測量程序是線性的[1]，此測定結果指最終的分析結果，而不是儀器輸出的原始信號[2]。測定結果與真實的量值存在比例關系，線性測量程序有助于揭示疾病的嚴重性與真實量值之間的關系。在臨床診療中，臨床醫生可以根據患者樣本測定結果的變化進行決策。線性對于定量測量的程序和分析方法極為重要，是方法學性能評價的重要指標之一[3]。2003年，美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）發布了EP06-A文件，作為線性評價指南EP06-P文件的更新版本[4]。EP06-A文件主要通過多項式回歸分析，檢查非線性模型是否比線性模型更適合于數據組，然后評價最適非線性模型與線性模型每個點的差值是否小于該方法所允許的偏差。2013年，我國國家衛生健康委發布了推薦性衛生行業標準WS/T 408—2012[2]，為臨床實驗室建立和驗證線性提供指引，其評價方案與EP06-A類似。2019年，中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）也發布了關于線性驗證的指南文件CNAS—GL038：2019[5]。目前，實驗室進行定量測量程序的線性驗證也多參考這些指南[6-9]。2020年，CLSI發布了EP06-A文件的更新版本，即EP06-Ed2文件[1]，對定量測量程序線性區間的確認或驗證程序、評價樣本準備、數據分析處理、結果解釋等方面作了較大調整。本研究以三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）項目為例，探討CLSI EP06-Ed2文件在定量測量程序線性驗證中的應用。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

i3000全自動化學發光免疫分析儀（四川邁克公司）及配套T3試劑盒、FT3試劑盒、校準品。T3和FT3試劑盒說明書中聲明的線性區間分別為0.4～15.36 nmol/L和1～50 pmol/L。依據我國國家衛生健康委臨床檢驗中心室間質量評價標準，T3和FT3的總允許誤差（allowable total error，TEa）均設定為25%。本研究在進行線性驗證前已對檢測系統的精密度和正確度進行了驗證，結果均滿足實驗室要求。

1.2 方法

1.2.1 樣本準備 每個項目分別選擇接近線性區間上限和下限的2個樣本，將高濃度樣本標記為H，低濃度樣本標記為L，按5/6H+1/6L、4/6H+2/6L、3/6H+3/6L、2/6H+4/6L、1/6H+5/6L比例混合得到5個中間濃度的樣本，最終7個樣本按濃度由高到低依次標記為1～7號。每個濃度的樣本各重復檢測2次。所有樣本在1個批次內完成檢測。為避免樣本引入的攜帶污染影響，隨機安排樣本的檢測順序。

1.2.2 數據分析 統計線性組合樣本中每個樣本2次重復測定的均值（）和標準差（s），以s為自變量，x 為因變量，建立未加權、斜率為b0、截距為0的回歸方程Y=b0X。計算西格瑪（sigma，σ）值，公式為：σ=×b0。計算每個x的權重，公式為：權重=1/σ2。以每個樣本中高值樣本所占比例（P），即1、5/6、4/6、3/6、2/6、1/6、0為自變量，測量結果的為因變量，進行加權最小二乘（weighted least square，WLS）線性回歸，其中最低濃度的權重按1/s計算，回歸方程為：Y=bX+a。根據回歸方程計算每個樣本的預期值，并計算線性偏差，公式為：線性偏差=-預期值。按公式1、公式2計算線性偏差的95%可信區間（confidence interval，CI）。

1.2.3 結果判斷 當所有樣本線性偏差的95%CI與ADL相交時，整個區間的線性是可接受的，即線性區間得到驗證。

1.3 統計學方法

采用Excel 2016軟件進行統計分析。數據處理過程中不對中間結果做修約處理。

2 結果

2.1 T3和FT3檢測結果分析及加權后的線性回歸方程

各線性樣本T3和FT3重復檢測結果、、s及權重見表1、表2，加權后的線性回歸方程分別為Y=12.33X+0.45和Y=38.09X+1.33。

表1 T3重復檢測結果及各線性樣本權重

表2 FT3重復檢測結果及各線性樣本權重

2.2 T3和FT3各線性樣本線性偏差的95%CI與ADL

根據線性回歸方程分別計算T3和FT3各線性樣本的預期值、線性偏差、線性偏差的95%CI、ADL，結果見表3、表4。

表3 T3線性偏差CI與ADL

表4 FT3線性偏差CI與ADL

2.3 T3和FT3線性區間驗證結果

以預期濃度為X軸，線性偏差為Y軸，將線性偏差、線性偏差的95%CI、ADL作散點圖，其中T3第1～6號樣本線性偏差的95%CI在ADL范圍內，第7號樣本線性偏差在ADL范圍內，FT3第2～4號樣本線性偏差的95%CI在ADL范圍內，第1、5號樣本線性偏差在ADL范圍內，第6號樣本線性偏差未在ADL范圍內，但線性偏差的95%CI與ADL范圍有重疊，第7號樣本線性偏差的95%CI不在ADL范圍內。依據判定標準（當所有樣本線性偏差的95%CI與ADL相交時，整個區間的的線性是可接受的），T3的線性區間通過驗證，而FT3的線性驗證未通過。見圖1、圖2。

圖1 T3項目線性樣本的線性偏差、線性偏差的95%CI和ADL

圖2 FT3項目線性樣本的線性偏差、線性偏差的95%CI和ADL

3 討論

線性作為定量測量的程序和分析方法重要的性能指標，其評價方案在臨床應用中不斷發展[10-11]，與CLSI EP06-A文件中多項式回歸方法相比，CLSI EP06-Ed2文件采用了一種更簡單、直觀的方法：重復測量5個或6個濃度跨越線性區間要求的樣本，然后將測量結果與通過加權回歸分析的樣本的預期值進行比較，根據ADL評估線性偏差，用95%CI檢查并驗證線性區間的一致性。

EP06-Ed2文件在線性驗證樣本濃度區間選擇方面有較強的指導性。由于儀器軟件的限制，一般對超過測量區間上限（upper limit of quantitation，ULoQ）和/或測量區間下限（lower limit of quantitation，LLoQ）的樣本，實驗室可能無法獲得樣本中待測物真實的濃度；同時，由于測量程序固有的不精密度，實驗室可能無法對非常接近但不超過LLoQ或ULoQ，特別是LLoQ的樣本，得出一致的結果。所以在選擇線性驗證樣本的濃度區間時，可略窄于由LLoQ和ULoQ組成的分析測量區間。除了高、低濃度樣本外，還需要3個（或更多）中間濃度樣本，可通過高、低濃度樣本按比例制備。線性區間評價所需的重復測量次數由測量程序的重復性和ADL確定，一般驗證實驗應至少對每個樣本在1個批次內重復檢測2次。為確保2次單獨測量在95%的概率內返回數值結果，即測量的結果不會有“＞ULoQ”或“＜LLoQ”，對于重復性[變異系數（coefficient of variation，CV）]為5%～10%的測量程序，高值樣本濃度可比ULoQ低15%，對LLoQ處重復性（CV）為20%的測量程序，低值樣本濃度可比LLoQ高30%～40%。

EP06-Ed2文件數據分析的一個顯著特征是使用WLS線性回歸分析。當測量程序的重復性標準差（s）明顯依賴于濃度時，加權可防止高濃度樣本對數據的線性擬合產生不成比例的影響。測量程序在其分析測量區間內具有相對恒定的重復性（CV），但隨著數值接近于零，CV開始快速升高，最低濃度的樣本CV通常比較大，所以最低濃度樣本的權重按照1/s計算。以每個樣本中高值樣本所占比例（P）作為自變量，測量結果作為因變量，進行加權線性回歸，根據得到的回歸方程計算每個樣本的預期值。與進行線性回歸方法類似的是，在我國衛生行業標準WS/T 420—2013和第4版《全國臨床檢驗操作規程》中[12-13]，線性驗證以稀釋度為自變量，每個樣本的測量為因變量做線性回歸，未規定對測量結果做加權處理。

在所有線性驗證的指南中，數據除了統計學上的處理外，都要與臨床應用相關聯，確定ADL是線性驗證的關鍵步驟。線性偏差是系統誤差（偏移）的一部分，所以ADL不應大于允許的偏移。根據測量程序預期臨床用途，ADL可以是一個常數（固定）值、相對值或兩者組合中的較大值。在我國國家衛生健康委臨床檢驗中心室間質量評價標準中，T3和T4項目可接受范圍均為±25%，澳大利亞皇家病理學家學會質量評估計劃設置的T3可接受范圍為±15%或±0.2 nmol/L，FT3的可接受范圍為±20%或±0.7 pmol/L。本研究設定2個項目ADL均為±12.5%。

按照WS/T 420—2013[12]中未加權的線性回歸分析，本研究FT3最低濃度樣本的偏差為0.34 nmol/L和55.42%，按照EP06-A的多項式回歸分析，T3判斷為線性。由于甲狀腺素結合球蛋白濃度及結合力改變，稀釋會造成FT3結果不按比例變化，干擾數據的判斷，FT3判斷為非線性，其最適擬合為三項式，其最低濃度樣本偏差為-0.56 pmol/L和-47.5%，均超出本研究設定的ADL，判定為驗證不通過。但如果設定ADL為±0.7 pmol/L和±12.5%，FT3則為可接受的非線性。

計算線性偏差的95%CI，采用95%CI檢查并驗證的線性區間的一致性。當所有樣本線性偏差的95%CI與ADL相交時，整個區間的線性是可接受的，即線性區間得到驗證。在解釋線性驗證結果時，應考慮以下因素[1]：（1）如果線性偏差的95%CI與ADL重疊，實驗結果并不能否定線性聲明；（2）當整體性能特征足以滿足臨床需要時，實驗室有理由接受線性實驗的結果；（3）當整體性能特征不足以滿足臨床需要時（即超過TEa），不應接受實驗結果，應進行進一步調查。當懷疑存在技術錯誤或其他可識別的原因時，實驗室應采取相關的切實可行的措施（如重新校準、常規維護程序）來消除驗證失敗的任何可能原因，通過重復實驗加以確認。

本研究中T3項目所有樣本線性偏差均在ADL范圍內，線性區間得到驗證；FT3項目有1個點線性偏差的95%CI不在ADL范圍內，依據判定標準，FT3線性驗證未通過，這與依據CLSI EP06-A文件得出的結論一致。分析FT3項目未通過驗證的原因，除樣本稀釋可能造成的影響外，還包括選擇的最低濃度樣本略低于LLoQ、重復性造成的影響、ADL的選擇（特別是低濃度ADL）以及單一使用相對值的影響。

綜上所述，CLSI EP06-Ed2文件相對于CLSI EP06-A等文件，對線性樣本濃度選擇的要求更明確、更合理，數據分析處理更有效和簡便，是非常實用的定量測量程序線性驗證指南。