健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標參考區間的建立及其影響因素分析

苗林子， 陸 遙， 屈晨雪， 由 然， 龔 巖

（北京大學第一醫院，北京 100034）

CD64是免疫球蛋白IgG Fc段的Ⅰ型受體，屬于免疫球蛋白超家族的成員，主要分布于外周血單核巨噬細胞、樹突細胞等抗原提呈細胞表面[1]。近年來，CD64作為一種新的感染相關指標，受到越來越多的關注[2-5]。有文獻報道，相較于系統性炎癥反應綜合征，膿毒血癥患者中性粒細胞CD64明顯升高[6]；膿毒血癥早期表達CD64的中性粒細胞絕對數值低于2 500個/μL的患者，預后較好[7]；CD64在鑒別感染與其他原因引起的發熱中有重要的作用[8]。HLA-DR分子表達在巨噬細胞、樹突細胞、B淋巴細胞等抗原提呈細胞和單核細胞表面，參與抗原提呈和T淋巴細胞的活化，對特異性免疫十分重要[9]。有研究發現，單核細胞表面HLA-DR表達降低的創傷患者并發感染和膿毒血癥的比例更高[10]。LEKKOU等[11]發現，死亡組嚴重社區獲得性感染和膿毒血癥死亡患者單核細胞HLA-DR在入院3、10、13和17 d時，均顯著低于存活患者，因此HLA-DR可作為預后判斷的早期和持續性監測指標。目前，我國尚未將白細胞表面CD64和HLA-DR廣泛應用于臨床，原因之一是未建立健康成人的參考區間。由于使用流式細胞術檢測白細胞表面CD64和HLA-DR的成本較高等因素，目前只有極少數的臨床實驗室用極少量樣本建立了自己的參考區間，用于科研和極少數臨床需要，但因其健康人群篩選不嚴格，樣本例數較少而不具代表性。本研究旨在通過流式細胞術檢測健康成人白細胞表面CD64和HLADR的表達，并通過公式計算相應的指標，初步分析其在不同年齡、不同性別健康成人之間的差異，建立健康成人白細胞表面CD64和HLADR相關指標的參考區間，為這些指標的臨床應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年3—11月北京大學第一醫院行健康體檢的22～60歲成人200名。通過調查問卷和體格檢查確定研究對象身體健康、無現病史；排除乙型肝炎、丙型肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征和梅毒感染者，排除急、慢性感染性疾病和自身免疫性疾病、過敏性疾病或癌癥患者，以及3個月內服用過影響免疫系統的藥物、4周內接種過疫苗、1年內接受過輸血或6個月內獻血者。此外，參考血常規、血生化（肝、腎功能）、尿常規等實驗室指標是否完全正常，以決定研究對象是否入選。最終納入126名符合標準的健康體檢者，其中男69名、女57名。本研究通過北京大學第一醫院倫理委員會審核[倫理編號為（2018）科研第（145）號]。

1.2 儀器和試劑

美國BD公司CD64（克隆號10.1）、HLA-DR（克隆號L243）、CD45（克隆號2D1）、CD14（克隆號MφP9）單克隆抗體。美國BD公司FACS CantoⅡ流式細胞儀和FACS Diva分析軟件。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采用美國BD公司Vacutainer乙二胺四乙酸采血管，以無菌靜脈穿刺方式采集研究對象至少1 mL的全血，用于完成體檢臨床實驗室檢測后，使用剩余全血樣本（血常規樣本）進行染色和上機檢測。

1.3.2 細胞染色 抗凝全血樣本采集后8 h內完成細胞染色。分別將20、20、20、5 μL的CD64、HLA-DR、CD14、CD45單克隆抗體加入上樣管，再加入100 μL抗凝全血，輕輕混勻振蕩，室溫（20～25 ℃）環境下避光孵育15 min，然后加入2 mL FACS溶血素，充分混勻，于室溫（20～25 ℃）環境下避光孵育10 min，300×g離心5 min后棄去上清，加入2 mL磷酸鹽緩沖液混勻，300×g離心5 min后棄去上清，再加入500 μL磷酸鹽緩沖液混勻，上機檢測。如果無法立即上機檢測，則將染色后的樣本室溫（20～25 ℃）放置，避光儲存。

1.3.3 流式細胞儀檢測和結果分析 首先進行流式細胞儀的日常設置和自動質控，確保儀器和質控在控。細胞染色后1 h內進行流式分析檢測。檢測前，充分混勻振蕩細胞（低速）以減少細胞聚集；調整閾值，使細胞碎片降至最低，確保檢測包含目標細胞群。按照單核細胞數2 000個設定收集終點，收集結束后，用FACS Diva軟件來進行分析，以CD14陽性設門圈出單核細胞，以CD45設門圈出淋巴細胞和中性粒細胞，顯示各細胞群CD64、HLA-DR平均熒光強度和熒光強度中位數。分別列出中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞的CD64和HLA-DR平均熒光強度、熒光強度中位數，計算中性粒細胞CD64指數、中性粒細胞與單核細胞CD64比值、中性粒細胞與淋巴細胞CD64比值、CD64比率，以及HLA-DR相關指標（單核細胞HLADR平均熒光強度、單核細胞HLA-DR熒光強度中位數、單核細胞與淋巴細胞HLA-DR比值，單核細胞與中性粒細胞HLA-DR比值）。計算公式為：CD64指數平均熒光強度=（中性粒細胞CD64平均熒光強度/淋巴細胞CD64平均熒光強度）/（單核細胞CD64平均熒光強度/中性粒細胞CD64 平均熒光強度）；中性粒細胞與單核細胞CD64比值%平均熒光強度=中性粒細胞CD64平均熒光強度/單核細胞CD64平均熒光強度×100%；中性粒細胞與淋巴細胞CD64比值平均熒光強度=中性粒細胞CD64平均熒光強度/淋巴細胞CD64平均熒光強度；CD64百分比平均熒光強度=（中性粒細胞CD64平均熒光強度-淋巴細胞CD64平均熒光強度）/（單核細胞CD64平均熒光強度-中性粒細胞CD64平均熒光強度）×100%；CD64指數熒光強度中位數=（中性粒細胞CD64熒光強度中位數/淋巴細胞CD64熒光強度中位數）/（單核細胞CD64熒光強度中位數/中性粒細胞CD64熒光強度中位數）；中性粒細胞與單核細胞CD64比值%熒光強度中位數=中性粒細胞CD64熒光強度中位數/單核細胞CD64熒光強度中位數×100%；中性粒細胞與淋巴細胞CD64比值熒光強度中位數=中性粒細胞CD64熒光強度中位數/淋巴細胞CD64熒光強度中位數；CD64百分比 熒光強度中位數=（中性粒細胞CD64熒光強度中位數-淋巴細胞CD64 熒光強度中位數）/（單核細胞CD64熒光強度中位數-中性粒細胞CD64熒光強度中位數）×100%；中性粒細胞與單核細胞CD64比值熒光強度=中性粒細胞CD64平均熒光強度/單核細胞CD64平均熒光強度×100%；單核細胞與淋巴細胞HLA-DR比值平均熒光強度=單核細胞HLA-DR平均熒光強度/淋巴細胞HLA-DR平均熒光強度；單核細胞與中性粒細胞HLA-DR比值平均熒光強度=單核細胞HLA-DR平均熒光強度/中性粒細胞HLA-DR平均熒光強度；單核細胞與淋巴細胞HLA-DR比值熒光強度中位數=單核細胞HLA-DR熒光強度中位數/淋巴細胞HLA-DR熒光強度中位數；單核細胞與中性粒細胞HLA-DR比值熒光強度中位數=單核細胞HLA-DR熒光強度中位數/中性粒細胞HLA-DR熒光強度中位數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。若數據服從正態分布，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用完全隨機設計的方差分析檢驗，多組間兩兩比較采用LSD檢驗，參考區間以x±1.96s表示；若不服從正態分布，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH秩和檢驗，多組間兩兩比較采用bonferroni方法對檢驗水準進行調整，參考區間以P2.5～P97.5表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標參考區間

白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標數據均呈偏態分布。檢測結果和參考區間見表1。

表1 126名健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標檢測結果

2.2 不同性別健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標檢測結果比較

男性與女性健康成人白細胞表面CD64和H L A-D R相關指標差異無統計學意義（P＞0.05），故無需按性別建立參考區間。

2.3 不同年齡組白細胞表面CD64 和HLA-DR相關指標檢測結果比較

將126名研究對象按年齡分為22～29歲（28名）、30～39歲（22名）、40～49歲（28 名）和50～60歲（48名）4個組。各年齡組之間CD64相關指標差異均無統計學（P＞0.05），單核細胞HLA-DR平均熒光強度、單核細胞HLA-DR熒光強度中位數、單核細胞與中性粒細胞HLA-DR比值（平均熒光強度）差異均有統計學意義（P＜0.05）。22～29歲組單核細胞HLADR平均熒光強度低于40～49歲組和50～59歲組（P值分別為0.023、0.007），18～29歲組單核細胞HLA-DR熒光強度中位數低于50～59歲組（P=0.034），其他各年齡組之間單核細胞表面HLA-DR相關指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同年齡組單核細胞表面HLA-DR相關指標檢測結果比較

2.4 健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標參考區間的初步建立

因白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標數據均呈偏態分布，因此以百分位數法（P2.5～P97.5）建立各項目參考區間。根據性別和年齡的分組比較結果，除單核細胞HLA-DR平均熒光強度合并年齡組后建立22～39歲及40～59歲的參考區間，單核細胞HLA-DR熒光強度中位數合并年齡組后建立22～49歲及50～59歲的參考區間外，其他各項目均建立統一的參考區間。見表3。

表3 健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標的參考區間

3 討論

CD64主要表達于單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞等抗原遞呈細胞表面[1]。正常情況下，CD64在這些細胞表面高表達，而在淋巴細胞和多形核細胞表面低表達。當機體發生感染時，會產生抗體，此時中性粒細胞表面CD64表達上調。這是由于CD64能以高親和力結合單體IgG，所以在抗體反應過程中，CD64上調使中性粒細胞與病原體特異性IgG結合，增強抗體依賴性細胞介導細胞毒作用，促進中性粒細胞吞噬細菌[12]。

HLA-DR表達在巨噬細胞、樹突細胞、B淋巴細胞等抗原提呈細胞以及單核細胞表面，參與抗原提呈和T淋巴細胞活化[9]。人體對膿毒血癥的免疫反應分為2個連續階段，在膿毒血癥初期會出現全身炎癥反應，此時可表現為單核細胞HLA-DR表達正常或升高，之后的免疫反應中，代償性抗炎反應占主導地位，表現為免疫系統抑制，使機體從炎癥狀態中恢復穩態，抗炎反應會引起單核細胞下調HLA-DR表達[13-14]。單核細胞HLA-DR表達下調是膿毒血癥誘導免疫抑制的標志[15]。

因此，檢測白細胞表面CD64和HLA-DR表達，對感染性疾病的早期診斷、治療監測、預后判斷有重要價值[6-8，15-17]。由于CD64和HLA-DR均表達于細胞表面，且分子結構較穩定，適合采用流式細胞術檢測，與其他生物學標志物相比，具有用血量少、檢測所需時間短的優勢。

合理的參考區間是實驗室檢測的基礎，是臨床醫生進行疾病診斷的重要標準。由于急慢性感染、腫瘤、自身免疫性疾病、服用藥物、輸血等均可能對檢測結果造成影響，因此我們在問卷調查中設計并排除了這些情況；此外，我們通過參考血常規、血生化（肝、腎功能）、尿常規等實驗室指標排除了其他一些健康影響因素，采用流式細胞術檢測采集篩選到的健康人樣本中白細胞表面CD64及HLA-DR的表達，初步建立了健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標的參考區間。

與其他流式細胞術檢測指標相同，CD64和HLA-DR也缺乏標準化的指標，目前相關文獻中提到的CD64指標主要包括：中性粒細胞CD64陽性百分比、中性粒細胞CD64平均熒光強度、中性粒細胞CD64熒光強度中位數、CD64指數。熒光強度、陽性百分比受試劑、儀器電壓、補償等設定參數和陰性對照設置、人員差異影響較大，不易實現較好的重復性和實驗室間可比性。另外，由于中性粒細胞表面CD64表達上調是整個細胞群體CD64分子數的上調，CD64陽性細胞數量所占比例的改變不能反映CD64表達的變化[18]。目前，大多數研究采用CD64指數反映CD64表達變化[19-24]。關于CD64指數的計算公式，各實驗室并不統一，國外研究大多應用商品化試劑盒，計算公式為：CD64指數=中性粒細胞CD64平均熒光強度/微球平均熒光強度[19-20]，但試劑盒成本較高，不適合臨床常規使用。我國早期一些研究將中性粒細胞CD64指數定義為中性粒細胞CD64平均熒光強度/淋巴細胞CD64平均熒光強度[22-24]；近年來的計算公式為：CD64指數=（中性粒細胞CD64平均熒光強度/淋巴細胞CD64平均熒光強度）/（單核細胞CD64平均熒光強度/中性粒細胞CD64平均熒光強度）[18，21]，該公式綜合考慮了作為陰性對照的淋巴細胞和作為陽性對照的單核細胞CD64平均熒光強度因素，既可對CD64進行量化，又可減少人為因素帶來的誤差，從而使結果更客觀[18]，本研究將此公式計算結果定義為CD64指數。本研究基于平均熒光強度和熒光強度中位數計算健康成人CD64指數較其他CD64相關指標的變異系數均較小，更適合臨床使用。本研究計算CD64指數參考區間上限與之前研究的臨界值[18，21]略有差異，建立的基于平均熒光強度計算的CD64指數參考區間為0.06～2.73。閆佩毅等[18]的研究結果顯示，42名健康對照者CD64指數的波動范圍為0.40～1.31，可能由于人數過少，因此波動區間更小，但中位數與本研究接近。萬歲桂等[21]通過受試者工作特征曲線計算得到血液病患者感染組與非感染組CD64指數的最佳臨界值為4.96，較本研究參考區間上限略高，可能是選擇的人群不同所致。

同樣，單核細胞HLA-DR平均熒光強度、單核細胞HLA-DR熒光強度中位數、單核細胞HLADR陽性百分比也受儀器電壓、補償等設定參數以及對照的設置影響較大，因此不適合在臨床檢測中使用；基于平均熒光強度及熒光強度中位數計算的健康成人單核細胞與中性粒細胞HLA-DR比值的變異系數均較小，更適合臨床使用，然而相關文獻中大多應用單核細胞平均熒光強度[25]，因此無法與本研究結果進行比較。

此外，本研究初步探索了年齡、性別對健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標參考區間的影響，結果顯示，隨著年齡的增長，白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標呈現不同的變化趨勢。本研究將研究對象劃分為18～29歲、30～39歲、40～49歲和50～59歲4個年齡組，結果顯示，白細胞表面CD64相關指標在各年齡組間差異無統計學意義（P＞0.05）；單核細胞HLA-DR平均熒光強度、單核細胞HLA-DR熒光強度中位數、單核細胞與中性粒細胞HLADR比值（平均熒光強度）有隨年齡增長逐漸升高的趨勢，可能與年齡增長使累積暴露的感染因子增多，引起免疫上調有關。本研究初步分析了各年齡段健康成人白細胞表面CD64和HLADR相關指標的參考區間，但由于年齡分組后例數較少，可能存在偏移，建議在使用單核細胞HLA-DR平均熒光強度、單核細胞HLA-DR熒光強度中位數、單核細胞與中性粒細胞HLA-DR比值（平均熒光強度）這些指標時進行進一步驗證，或建立各年齡段的參考區間，更有利于作出準確、合理的臨床決策。本研究未發現男性和女性的白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標存在差異，提示性別差異不是白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標參考區間的影響因素。

綜上所述，白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標在感染性疾病的診斷、鑒別診斷、預后判斷及治療檢測上應用前景較好，本研究初步建立了健康成人白細胞表面CD64和HLA-DR相關指標的參考區間，是少數采用嚴格篩選標準篩選健康成人建立的參考區間，為進一步將這些指標應用于臨床提供了必要的參考。同時，本研究發現年齡是影響白細胞表面HLA-DR相關指標參考區間的因素，建議進一步建立各年齡段的參考區間，會更有利于臨床參考。