基于二代測序技術的常染色體隱性遺傳性多囊腎病家系胚胎植入前遺傳學分析

何天文， 盧 建， 陳創奇， 劉 頓， 丁紅珂， 劉 玲， 杜 麗， 鄭毅春， 尹愛華

（1.廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心，廣東 廣州 511442；2.廣東省婦幼保健院生殖中心，廣東 廣州 511442）

常染色體隱性遺傳性多囊腎病（autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD）是一種罕見的常染色體隱性遺傳的單基因病，致病基因為多囊腎/多囊肝病變1（polycystic kidney and hepatic disease 1，PKHD1）基因[1]。ARPKD在臨床上比較罕見，發病率僅為1/40 000～1/20 000，以腎臟和肝臟為主要累及器官，臨床表型為雙側腎臟均勻對稱性增大，并常伴有肝脾腫大、肝硬化及膽管擴張等癥狀，多數患兒于圍產期或嬰幼兒時即發病死亡[2-3]。ARPKD發病早、預后極差，目前臨床尚無根治的辦法，主要通過植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）或產前診斷預防ARPKD患兒的出生。近年來，二代測序[又稱下一代測序（next generation sequencing，NGS）]技術飛速發展，測序成本不斷降低，應用領域不斷擴大。NGS的準確性好、精度高，目前已經成為胚胎PGT的主要方法之一，能檢測染色體非整倍性、染色體結構異常和單基因遺傳病[4-5]。國內外運用NGS技術對ARPKD家系進行PGT的報道較少，目前僅發布了《應用胚胎植入前遺傳學檢測技術阻斷常染色體顯性多囊腎病遺傳的中國專家共識》[6]。為此，本研究對1個ARPKD家系進行PKHD1基因測序，在明確PKHD1基因致病突變的情況下，運用NGS技術對胚胎PKHD1基因突變位點進行直接測序，并構建胚胎PKHD1基因突變位點連鎖單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點單倍型，為胚胎PTG和ARPKD產前診斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

先證者父親（Ⅰ1）：35歲，表型正常，既往體健。先證者母親（Ⅰ2）：33歲，表型正常，既往體健，G2P1A2，2012年8月剖宮產一足月女（先證者）；2016年12月孕8周胚胎停育，藥物流產，未對絨毛進行相關基因檢測。先證者（Ⅱ1）：女，5歲，因血尿、蛋白尿以及B超顯示腎臟有多發性囊狀改變、肝臟囊性病變進行遺傳性腎病相關基因檢測，外院檢測結果顯示PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G雙重雜合突變，見圖1。為了避免再次妊娠ARPKD患兒，該夫婦于2017年8月在廣東省婦幼保健院醫學遺傳中心和生殖醫學中心就診咨詢要求行PGT。向該夫婦充分解釋PGT過程及相關風險后，該夫婦簽署知情同意書并接受PGT。本研究經廣東省婦幼保健院生殖醫學倫理委員會批準。

圖1 ARPKD家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及基因組DNA提取 采集先證者父母和先證者的靜脈血各2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，采用磁珠法血液基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取外周血基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書操作。PGT后，先證者母親于孕18～24周時在超聲引導下行羊膜腔穿刺術，抽取羊水10 mL。采用Qiamp DNA Blood Mini Kit（德國Qigen公司）提取羊水基因組DNA，按照試劑盒說明書進行提取操作。

1.2.2 Sanger測序調查家系成員PKHD1基因突變情況 采用Oligo6軟件（美國Oligo公司）設計針對PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變位點的特異性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物。對擴增產物進行Sanger測序，測序儀器為ABI3730遺傳分析儀（美國ABI公司）。采用SeqMan軟件進行序列分析，觀察PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G的突變情況。

1.2.3 構建父母雙方和先證者SNP單倍型 以PKHD1基因編碼區為目標區域，在該基因上下游2M區域內選擇120個高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳連鎖標記，在Ion AmpliSeq Designer網站（https：//www.ampliseq.com）上設計多重PCR引物。擴增產物經純化、建庫、NGS后，選擇有效SNP位點構建先證者父母和先證者的SNP單倍型，連鎖分析后確定先證者父母攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風險染色體。

1.2.4 胚胎培養及胚胎活檢 常規促排卵取卵后，采用卵細胞質內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）方式進行授精，受精后轉入分裂期胚胎培養液繼續培養，分別于培養第3、5、6天觀察胚胎發育情況。胚胎發育第3天時用激光脈沖在透明帶上切割出1個直徑約20 μm的裂口，將胚胎轉移至囊胚培養液中繼續培養。胚胎發育第5天、第6天時觀察到囊胚形成且脫出裂口滋養層細胞數為2～9個時進行活檢。用活檢針吸取脫出裂口的滋養層細胞，在磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）液滴中清洗后轉入PCR反應管中。對活檢的囊胚編號后進行玻璃化冷凍處理，待遺傳學檢測完成后再行解凍移植。

1.2.5 胚胎PGT 對活檢獲得的滋養層細胞進行基于等溫多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）技術的全基因組擴增。全基因組擴增產物通過多重PCR擴增PKHD1基因編碼區和高密度緊密連鎖的SNP。多重PCR擴增產物經純化和建庫后進行NGS。采用NGS對胚胎PKHD1基因突變位點進行直接測序，構建PKHD1基因突變連鎖SNP單倍型并進行連鎖分析。采用Sanger測序驗證胚胎PKHD1基因突變位點的NGS結果。針對正常和雜合攜帶的胚胎進行低深度的染色體非整倍性篩查，以排除攜帶染色體拷貝數異常的胚胎。

1.2.6 胚胎移植和產前診斷 選擇未檢測到突變且發育良好的整倍體胚胎于凍融胚胎周期進行移植。胚胎移植14 d后查血人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）確定是否妊娠；胚胎移植4周后行經陰道B超確定是否臨床妊娠。孕18～24周時行羊膜腔穿刺，進行染色體核型分型和PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變產前診斷，以驗證PGT結果。

2 結果

2.1 ARPKD家系成員攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G.突變情況

Sanger測序結果顯示，ARPKD家系成員中，父親攜帶PKHD1基因c.5935G＞A，為雜合子；母親攜帶PKHD1基因c.10058T＞G，為雜合子；先證者攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G雙重雜合突變，分別遺傳自父親和母親。見圖2。

圖2 先證者及其父母PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變Sanger測序圖

2.2 先證者父母和先證者的SNP單倍型

以PKHD1基因編碼區為目標區域，在上下游2M區域內選擇120個高密度緊密連鎖的SNP位點作為遺傳連鎖標記。經過多重PCR和NGS檢測后，選擇69個有效SNP位點構建先證者父母和先證者的SNP單倍型，確定先證者父母攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風險染色體。見表1。

表1 先證者父母有效SNP位點數和分布

2.3 植入前遺傳學診斷

培養第5天觀察到5個胚胎達到活檢標準，即對囊胚進行活檢和胚胎玻璃化冷凍保存，將活檢產物標記為D501、D502、D503、D504和D505，每個樣本活檢細胞數為2～9個。采用NGS對胚胎PKHD1基因突變位點進行直接測序、胚胎單倍型連鎖分析，同時采用Sanger測序進行驗證。結果顯示，5個胚胎中，D501和D502未檢測到突變，D503和D505攜帶PKHD1基因c.5935G＞A突變（雜合子），D504攜帶PKHD1基因c.10058T＞G突變（雜合子）。見表2、圖3。

圖3 胚胎單倍型連鎖分析結果

表2 5個胚胎PKHD1基因c.472C＞T突變NGS和Sanger測序結果

對5個胚胎進行低深度染色體非整倍體篩查，結果顯示，D501、D503和D505為整倍體胚胎，D502和D504為非整倍體胚胎。見表3。

表3 胚胎PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變PGT結果

2.4 等位基因脫扣率（allele drop-out，ADO）分析

5個活檢胚胎的PKHD1基因致病突變位點c.5935G＞A（chr6：51799094）和c.10058T＞G（chr6：51609281）未發生脫扣。根據5個活檢胚胎的2個致病突變位點和69個SNP位點的脫扣等位基因數得出復合ADO率為0.81%。

2.5 胚胎移植及產前診斷

囊泡活檢后，在第3個月經周期行囊胚解凍移植。參考PGT結果選擇遺傳學檢測結果為未檢測到突變且發育良好的整倍體胚胎（D501）進行移植。移植14 d后檢測外周血hCG為陽性，移植50 d后經陰道超聲檢查見單個孕囊，大小為34 mm×22 mm，胚芽長9 mm，可見心管搏動。孕18周經羊膜腔穿刺產前診斷結果顯示，胎兒染色體核型分型無異常，未檢測到PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變（圖4），與PGT結果一致。孕38周順產一正常嬰兒，健康狀況良好。

圖4 胎兒PKHD1基因c.5935和c.10058位點的Sanger測序

3 討論

ARPKD是一種罕見的常染色體隱性遺傳的單基因病，致病基因為PKHD1基因。PKHD1基因是目前所知人類ARPKD的唯一致病基因，定位于人類染色體6p21，約為472 kb，包含67個外顯子，編碼1個由4 074個氨基酸組成的單次跨膜受體樣蛋白——纖維素蛋白[7-8]。PKHD1基因以編碼區的點突變致病為主，非編碼區突變、大片段缺失、重復或重排只是致病原因的極少數。目前，基因變異數據庫（http：//www.humgen.rwth-aachen.de）中報道的PKHD1突變種類已達748種，其中約60%為錯義突變，40%為截短突變（無義突變、剪切突變和移碼突變）[9]，其中c.107C＞T（p.Thr36Met）和c.9689delA（p.Asp3230ValfsX9）是相對常見的突變，約占20%[10-11]。PKHD1基因發生突變會導致該蛋白結構或功能異常，從而影響腎臟集合系統及肝臟膽管系統發育及成熟。ARPKD以腎臟和肝臟為主要受累器官，臨床表型為雙側腎臟均勻對稱性增大，并常伴有肝脾腫大、肝硬化及膽管擴張等癥狀，多數患兒于圍產期或嬰幼兒時即發病死亡。ARPKD與大多數單基因疾病一樣，尚無有效的根治方法。攜帶PKHD1基因突變的夫婦每次生育下一代都有25%的概率患ARPKD，通過產前診斷雖然可以防止ARPKD患兒的出生，但是絨毛活檢、羊水穿刺、臍帶血穿刺等傳統的介入性產前診斷技術具有創傷性，孕婦有一定的流產風險。如果通過傳統的介入性產前診斷確診胎兒為ARPKD，則攜帶PKHD1突變基因的夫婦就需要選擇終止妊娠。因此，在胚胎植入前進行遺傳學檢測，并選擇正常胚胎進行移植，可以避免妊娠ARPKD胚胎，從而阻斷PKHD1基因突變在家系中的傳遞。同時還可以對胚胎進行低深度的染色體非整倍體篩查，以排除攜帶染色體拷貝數異常的胚胎，避免選擇非整倍體胚胎而導致的流產。因此，PGT與傳統的產前診斷相比具有明顯的優勢[11-12]。

由于每個胚胎活檢所得細胞數很少，提取的DNA量達不到分子檢測所需的水平，需要通過全基因組擴增的方法來擴增基因組DNA。基于MDA技術的全基因組擴增技術[13]不但克服了單細胞水平分子檢測DNA模板量過少的問題，也極大地提高了檢測結果的準確性和單細胞水平基因檢測的可靠性，但全基因組擴增技術會增加檢測結果擴增不均勻或等位基因脫扣的風險[14]。NGS將單堿基測序成本降至了最低，也給PGT帶來了革命性的改變[15]。有學者應用基于微衛星連鎖分析的方法進行多囊腎病的PGT[16]，相比之下，通過NGS完成植入前檢測的時間周期更短、更高效。與傳統的PGT技術，如熒光原位雜交和比較基因組雜交等相比，NGS具有明顯優勢，目前已逐漸成為PGT的主要檢測方法[17]。本研究以PKHD1基因編碼區為目標區域，在上下游2M區域內選擇120個高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳連鎖標記，選擇了69個有效SNP位點構建先證者父母的單倍型，確定其攜帶PKHD1基因c.5935G＞A和c.10058T＞G突變的風險染色體，減少了基因重組或全基因組擴增脫扣導致的檢測結果錯誤。本研究統計了5個活檢胚胎的2個致病突變位點和69個SNP位點的脫扣等位基因數，得出復合ADO率為0.81%。

綜上所述，本研究成功應用NGS技術對ARPKD家系進行PGT，阻斷了該單基因病在該家系中的再次發生，避免了選擇非整倍體胚胎而導致的流產問題，是ARPKD出生缺陷的有效預防方法。