外周血循環腫瘤細胞形態學分析技術在臨床檢驗中的應用

俞 琦， 孫 懿， 王瓊麗， 蔡逸婷， 李 莉

（1.上海市第一人民醫院檢驗科，上海 200080；2.保山市人民醫院檢驗科，云南 保山 678000）

隨著現代檢測技術的發展和應用，無創循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）檢測方法的敏感性和特異性不斷提高，其在臨床檢驗中的應用價值得到越來越多的重視。2000年，VONA等[1]首次利用CTC和正常血液細胞大小、形態等物理學差異和腫瘤細胞特有的形態特征，建立了上皮腫瘤細胞大小分離法（isolation by the size of epithelial tumor cell，ISET ），在外周血中通過顯微鏡檢出CTC。此項技術能完整地檢出各種表型的CTC，且快速、便捷、成本低，有利于后續實驗和研究的開展[2]。目前的主流富集技術中，免疫學技術缺乏廣譜且高特異性的腫瘤標志物，會造成異質性CTC無法檢出，ISET技術的缺點在于一些較大的單核細胞等容易與CTC混在一起，而一些較小的CTC容易被濾過而無法檢測到[2]。因此，目前還沒有一種方法可以完美地捕捉到循環中所有的CTC[3]。在CTC鑒定技術方面，免疫學仍然存在標志物特異性問題，逆轉錄-聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術靈敏度高，但不能觀察到完整細胞；而形態學方法具有快速、直觀、成本低等優勢。本研究采用獲得中國國家食品藥品監督管理局認證的CTCBIOPSY異常細胞分離染色系統，統計6類我國常見腫瘤患者外周血CTC的檢出情況，分析這種基于ISET技術和形態學判讀標準的CTC檢測技術在腫瘤臨床檢驗及科學研究中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年4月—2020年1月上海市第一人民醫院初次手術后經病理檢測確診的腫瘤患者，排除既往接受過腫瘤醫療干預，或合并嚴重心、肺、肝、腎功能疾病患者，納入212例腫瘤患者，其中肺癌患者72例、腸癌患者46例、胃癌患者38例、甲狀腺癌患者24例、乳腺癌患者18例、前列腺癌患者14例。TNM分期：原位癌3例、Ⅰ期45例、Ⅱ期55例、Ⅲ期55例、Ⅳ期54例。所有研究對象年齡、性別差異均無統計學意義（表1）。本研究通過上海市第一人民醫院倫理委員會審核（倫理批件編號：2018KY177），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 在患者手術或進行化療治療前，采用乙二胺四乙酸抗凝（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）真空采血管采集其肘靜脈血5 mL。為避免采血過程中發生上皮細胞污染，采用第2管之后抽取的血液標本用于CTC檢測。采血后，上下顛倒采血管，使血液與抗凝劑成分充分混合，血液標本在采集后2 h內處理。

1.2.2 標本前處理 用1 mL 75%醫用乙醇潤洗濾器（武漢友芝友公司），再用2 mL 0.9%Nacl溶液漂洗3次。向15 mL離心管中加入3 mL 0.9%Nacl溶液和200 μL固定劑（8% PFA）混勻，再加入5 mL血液標本顛倒混勻，室溫固定10 min，然后將待測標本加入濾器中，采用CTCBIOPSY異常細胞分離染色儀（武漢友芝友公司）檢測。

1.2.3 制片 分離完成后，取出濾器，向濾器內加入300 μL甲醇，室溫固定1 min后取出濾膜，將濾膜貼于玻片中央，室溫晾干后進行瑞-吉染色，50 ℃干燥箱放置30 min，滴加100%甘油封片后，進行鏡檢。

1.2.4 油鏡觀察 富集細胞形態評判參數[4-5]：（1）細胞核異型性，呈不規則的結節狀、分葉狀等；（2）核質比＞0.8；（3）細胞直徑（長端）＞15 μm；（4）核深染且著色不均勻；（5）核膜增厚，出現凹陷或皺褶，核膜呈鋸齒狀；（6）細胞核染色質邊移，或巨大核仁，或異常核分裂。評判標準[5]：（1）4個或4個以上參數符合判讀為CTC；（2）滿足評判參數（6）外的任意3個條件或單獨滿足評判參數（6）判讀為疑似CTC；（3）3個及以上的細胞成團，且能鑒定為CTC，但因相互連接重疊無法準確判讀為CTC的細胞團，判讀為循環腫瘤微栓（circulating tumor microemboli，CTM）；（4）3個及以上的細胞成團，但不足以判定為CTC的細胞團，判讀為疑似CTM；（5）不能判斷為血液來源的細胞，但同時也不符合上述4種類型的其他細胞，判讀為非血液細胞。計數判讀為CTC、疑似CTC、CTM和疑似CTM的細胞數量，并記錄坐標。

1.2.5 免疫組化檢測 鏡檢后，將玻片放入去離子水中上下潤洗去除甘油，依次放入100%乙醇（1 min）、95%乙醇（1 min）、75%乙醇（＞20 min），在去離子水中潤洗脫色。然后分別滴加100 μL 0.1% Triton X-100，室溫孵育15 min，洗凈后滴加100 μL 0.3% H2O2，室溫（18～26 ℃）孵育10 min，洗凈后分別加入100 μL CD45一抗（美國Abcam公司）和100 μL CD31一抗（美國Abcam公司），室溫（18～26 ℃）孵育2 h（或4 ℃過夜）。洗凈后加入100 μL山羊抗兔/小鼠IgG/HRP（上海威奧生物公司），室溫（18～26 ℃）孵育20 min。洗凈后滴加100 μL DAB顯色液顯色3～10 min，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化8 s，自來水返藍5 min。采用75%乙醇（1 min）、95%乙醇（1 min）、100%乙醇（1 min）梯度脫水，晾干，用中性樹脂封固，于CX23光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）下鏡檢。

1.3 統計學方法

采用R軟件（3.5.0版）進行統計學分析，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷數據是否呈正態分布（檢驗水準設定為0.10）。正態分布連續變量采用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。偏態分布的連續變量采用中位數（M）[四分位數（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。分類變量的比較采用χ2檢驗。等級變量先進行秩轉換后，再用Mann-Whiney U檢驗進行比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血CTC形態學檢出情況

細胞形態學檢查結果顯示，212例腫瘤患者外周血標本中有88例（41.51%）檢出CTC，其中16例檢出CTM。進一步通過CD45和CD31抗體同時進行免疫組化驗證，發現所有檢出CTC和CTM者CD45、CD31均為陰性，符合CTC和CTM免疫學特征。見圖1。

圖1 外周血CTC及CTM形態學檢查結果

2.2 CTC陽性組與陰性組各項參數比較

CTC陽性組與陰性組患者性別以及是否患糖尿病、高血壓和腫瘤類型差異無統計學意義（P＞0.05）；年齡（P＜0.05）、腫瘤原發灶（tumor，T）、區域淋巴結受累（node，N）、遠處轉移（metastasis，M）及TNM分期（P＜0.001）差異有統計學意義。見表1。

表1 CTC陽性組與陰性組各項參數比較

2.3 不同類型或不同分期腫瘤患者CTC檢出率比較

72例肺癌患者中，有34例（47.22%）檢出CTC，早期（Ⅰ、Ⅱ期）患者和中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者檢出率分別為9.68%和75.61%；46例腸癌患者中，有21例（45.65%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為33.33%和53.57%；38例胃癌患者中，14例（36.84%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為27.78%和45.00%；24例甲狀腺癌患者中，5例（20.83%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為11.11%和50.00%；18例乳腺癌患者中，7例（38.89%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為35.71%和50.00%；14例前列腺癌患者中，7例（50.00%）檢出CTC，早期和中晚期患者CTC檢出率分別為16.67%和75.00%。見圖2。

圖2 不同類型腫瘤患者不同分期CTC檢出率

2.4 不同類型腫瘤患者不同分期CTC計數比較

不同類型腫瘤早期與中晚期患者CTC計數有一定差異。30例肺癌早期（Ⅰ+Ⅱ期）患者CTC計數為（0.80±0.58）個/5 mL，顯著低于42例肺癌晚期（Ⅲ+Ⅳ期）患者[（8.64±1.88）個/5 mL]（P＜0.01）；6例前列腺癌早期（Ⅰ+Ⅱ期）患者CTC計數為（2±2）個/5 mL，顯著低于8例前列腺癌晚期（Ⅲ+Ⅳ期）患者[（24.63±11.71）個/5 mL]（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同類型腫瘤患者不同分期CTC計數比較

3 討論

本研究采用基于ISET的形態學方法在212例腫瘤患者中檢出88例CTC陽性。為了進一步評估該形態學CTC檢測方法的特異性，本研究通過CD45抗體免疫組化檢測排除形態學特征類似CTC的白細胞，通過CD31抗體免疫組化檢測排除形態特征類似CTC或CTM的血管內皮細胞，進而驗證形態學技術CTC檢測結果的假陽性率。細胞核染色為藍色（蘇木素） 且細胞膜染色為棕黃色（DAB） 即CD45或CD31陽性，為血液細胞或血管內皮細胞；而細胞核染色為藍色（蘇木素）且細胞膜周圍無棕黃色即CD45陰性且CD31陰性，為CTC或CTM（圖1）。通過免疫組化驗證發現，通過本形態學標準檢出的所有CTC和CTM細胞均符合CD45-CD31-的免疫學特征，說明該CTC形態學檢測方法和判讀標準的檢測特異性較高。

本研究檢測并統計了6種我國常見癌癥的CTC，總體檢出率為41.51%，其中前列腺癌CTC檢出率（50%，7/14）最高，肺癌（47.22%，34/72）次之，以下依次為腸癌（45.65%，21/46）、乳腺癌（38.89%，7/18）、胃癌（36.8%，14/38）、甲狀腺癌（20.83%，5/24）。同一類型癌癥，采用不同檢測方法，CTC的敏感性和特異性不盡相同[6]。如，在可切除非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，應用CellSearch可在19%～39%的患者中檢出CTC，采用ISET能在36%～50%的患者中檢出CTC[7]。迄今為止，尚沒有發現腫瘤細胞的特異靶標，最具代表性的CellSearch技術，其標志物EpCAM是上皮細胞的標志，當腫瘤細胞發生上皮-間質轉化時，則無法檢出[8]。與基于表面標志物的免疫親和吸附技術比較，本研究采用的方法可以減少腫瘤細胞上皮-間質轉化過程中表面標志物表達變化的影響，提高CTC和CTM的檢測效率。本研究采用的方法對CTC無選擇性，并能較完整地保留細胞成分，可用于后續細胞實驗和基因多樣性等研究，經濟、快捷，適合大批量標本的檢測，有較好的臨床和科研應用前景。然而，盡管CTC形態上比正常組織細胞的體積稍大，且不易變形，但極少量的微小CTC（直徑＜8 μm）可能無法被富集，這是本技術的不足之處。

本研究患者相關臨床參數比較結果顯示，CTC陽性組T4期患者、發生淋巴結轉移和遠處血行轉移患者所占比例較陰性組顯著增多（表1）。轉移性癌癥患者外周血中CTC的頻率約為每105～107個外周血單個核細胞中有1個CTC，高于局限性癌癥患者108個外周血單個核細胞中有1個CTC的頻率[9]。本研究免疫組化驗證結果顯示，CTC形態學分析技術在發生淋巴結和血行轉移性的中晚期癌癥患者外周血中檢出CTC的頻率更高。回顧以往研究，我們發現采用不同技術檢測CTC時，不同腫瘤患者臨床病理特征的關系不盡相同。一項納入84例胃癌患者的ISET技術研究發現，CTC和CTM檢出情況與瘤塊大小、有無淋巴結轉移、有無血管侵犯和遠處轉移灶有關[10]；而另一項采用陰性富集聯合免疫熒光原位雜交技術的針對32例胃癌患者和36例結直腸癌患者的研究則發現，CTC檢出結果與胃癌和結直腸癌患者的性別、年齡、淋巴結轉移、遠處器官轉移、病理分級均無相關性[11]。檢測方法學、樣本數量和研究群體的差異可能造成了上述差異。此外，本研究發現，CTC陽性組平均年齡較陰性組大，以往未見類似報道，考慮到可能存在抽樣誤差，還需擴大檢測樣本量和檢測人群，以進一步驗證。

以往的研究發現，9.4%～48.6%的早期乳腺癌患者體內可以檢出CTC，且提示早期復發和總生存期降低[12]。本研究發現，在腫瘤早期，乳腺癌的CTC檢出率最高（35.71%），腸癌、胃癌、前列腺癌依次降低，早期肺癌和甲狀腺癌CTC檢出率較低，肺癌和前列腺癌早期患者CTC計數與中晚期患者比較差異顯著，提示本研究采用的形態學檢測方法可以捕捉早期腫瘤患者外周血中的CTC，特別是在早期乳腺癌、腸癌和胃癌患者外周血中更易檢出，這可能與不同類型腫瘤不同時期外周血中CTC的豐度有關。

縱觀不同CTC檢測方法在不同類型腫瘤以及相同類型腫瘤的不同分期的廣泛的臨床研究，CTC檢測方法的敏感度、特異性、精確性和可重復性仍難以客觀判斷，目前還很難將單純的CTC定性檢測和計數運用到臨床決策[3]。值得欣喜的是，CTC的單細胞測序技術能夠克服CTC的異質性，發現腫瘤發生發展過程中新的驅動基因，揭示腫瘤轉移、耐藥及復發等機制[13]。對單個CTC或CTM癌基因和抑癌基因的鑒定、腫瘤生存分子的分析是未來研究的趨勢[14]。本研究采用的CTC形態學分析技術在單個CTC及CTM細胞的捕獲和鑒定方面具有經濟、特異性高、操作快速、高通量且細胞完整等優勢，在6類常見腫瘤的早、晚期均可檢出CTC，有一定的臨床應用價值，未來可以結合細胞顯微切割、單細胞測序等技術，針對單病種，結合療效和預后評估等，開展更深入的研究。