2種6色流式細胞術試劑檢測淋巴細胞亞群的性能比較

鞠穎慧， 莫惠芳， 吳 蕙， 陳 樸， 郭 瑋， 王蓓麗

（復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032）

流式細胞術目前已廣泛應用于淋巴細胞亞群分析、淋巴造血系統腫瘤免疫分型診斷和免疫功能測定等。淋巴細胞亞群檢測項目包括T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）、輔助性T淋巴細胞（T helper cell，Th；CD3+CD4+）、細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL；CD3+CD8+）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞（CD3-CD16+CD56+）。正常情況下，淋巴細胞數目穩定，疾病造成免疫功能異常可導致淋巴細胞數目改變，故其百分比及數量的測定可用于評估患者的免疫狀態，作為診斷、治療相關血液病和免疫缺陷疾病的重要依據，還可用于評價腫瘤患者、器官移植患者免疫治療效果以及移植物的存活情況[1]。染色指數（staining index，SI）是衡量陽性細胞群和陰性細胞群分離程度的一個可靠指標，與陽性細胞群的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）成正比，與陰性細胞群的MFI成反比，指數越大，分離效果越佳。目前，我國臨床實驗室使用的淋巴細胞亞群檢測試劑多為進口試劑，價格偏高，配貨周期長。為此，本研究擬對流式細胞術國產試劑與進口試劑檢測淋巴細胞亞群的性能進行比較，驗證2種試劑檢測結果的可比性。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2019年4—6月復旦大學附屬中山醫院就診患者96例、上海市徐匯區中心醫院就診患者50例、合肥市疾病預防控制中心固定監測的獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者54例，共計200例，其中男115例、女85例，年齡19～86歲。

1.2 儀器與試劑

FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）及配套進口6色TBNK試劑盒（簡稱進口流式試劑，CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-PC7/CD19-APC/CD8-APCCy7），TruCount絕對計數管（美國BD公司），7色儀器設置微球（美國BD公司），CS&T熒光校準微球（美國BD公司）。國產6色淋巴亞群檢測試劑盒（簡稱國產流式試劑，CD3-FITC/CD16-PE+CD56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PEPC7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7，北京同生時代生物技術有限公司）及配套絕對計數微球管。IMMUNO-TROL細胞質控品（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.3 方法

采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管（美國BD公司）采集所有對象靜脈血樣本，均于當天檢測完畢。FACSCantoⅡ流式細胞儀采用CS&T熒光校準微球和7色儀器設置微球校準到最佳狀態，質控在控后分別采用國產和進口2種流式試劑檢測淋巴細胞亞群（CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、CD19+細胞、CD3-CD16+CD56+細胞）。嚴格按儀器和試劑說明書操作。觀察指標包括細胞百分比、細胞絕對數、每種細胞2種試劑在相同電壓條件下的陽性峰和陰性峰間距、每種細胞百分比（絕對數）的線性范圍等。在相同加樣量、最佳光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）電壓條件下，通過2種試劑的MFI和相對標準偏差（robust standard deviation，RSD）來對淋巴細胞亞群的SI進行比較，計算公式為：SI=[MFI（陽性）-MFI（陰性）]/2×RSD（陰性）[2]。計算2種試劑之間的平均偏移，公式為：偏移（%）=（Yi-Xi）/Xi×100%，式中Yi為國產流式試劑結果，Xi為進口流式試劑結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。呈正態分布的數據以±s表示，2個組之間比較采用配對t檢驗。呈非正態分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用符號秩和檢驗。采用Spearman相關分析評估各項目之間的相關性。一致性采用組內相關系數（intraclass correlation coefficient，ICC）分析，ICC值的評價標準為：ICC＜0.4為可信度差，0.4～0.59為可信度中等，0.60～0.74為可信度良好，＞0.74為可信度優[3]。參考《流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南》[4]，將±5%作為允許誤差范圍，進行偏移的比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種流式試劑檢測結果比較

國產流式試劑的CD8+細胞和CD19+細胞百分比均低于進口流式試劑（P＜0.05），CD3+細胞百分比高于進口流式試劑（P＜0.05）。國產流式試劑CD3+細胞和CD19+細胞絕對數高于進口流式試劑（P＜0.05）。2種流式試劑檢測CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、CD19+細胞和CD3-CD16+CD56+細胞百分比的平均偏移分別為0.41%、-0.35%、2.11%、3.33%、-4.98%，絕對數的平均偏移分別為3.89%、0.98%、4.83%、4.13%、0.95%。見表1、表2。

表1 2種流式試劑淋巴細胞亞群百分比比較 %

表2 2種流式試劑淋巴細胞亞群絕對數比較 個/μL

2.2 國產流式試劑與進口流式試劑檢測結果的相關性分析

Spearman相關分析結果顯示，國產流式試劑與進口流式試劑的淋巴細胞亞群檢測結果的相關性良好（r＞0.9，P=0.000）。見表3、表4。

表3 國產流式試劑與進口流式試劑淋巴細胞亞群百分比檢測結果的相關性

表4 國產流式試劑與進口流式試劑淋巴細胞亞群絕對數檢測結果的相關性

2.3 國產流式試劑與進口流式試劑檢測結果一致性分析

國產流式試劑與進口流式試劑CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、CD19+細胞和CD3-CD16+CD56+細胞百分比檢測結果的ICC值[95%可信區間（confidence interval，CI）]分別為0.983（0.978～0.987）、0.990（0.986～0.992）、0.989（0.986～0.992）、0.987（0.983～0.990）、0.991（0.989～0.993），絕對數的ICC值（95%CI）分別為0.955（0.940～0.965）、0.970（0.961～0.977）、0.958（0.944～0.968）、0.992（0.989～0.994）、0.967（0.957～0.975），ICC值均＞0.95（P＜0.001）。2種流式試劑有較好的一致性。

2.4 國產流式試劑與進口流式試劑SI分析

國產流式試劑對CD3+細胞、CD8+細胞的SI高于進口流式試劑（P＜0.05），對CD4+細胞、CD19+細胞、CD3-CD16+CD56+細胞的SI低于進口流式試劑（P＜0.05）。見圖1。

圖1 國產流式試劑與進口流式試劑SI比較

3 討論

淋巴細胞亞群檢測可對影響機體免疫系統的多種因素的監測提供重要信息[5]。CD4+淋巴細胞計數是監測AIDS患者病情進展和療效評價的重要指標[6]。淋巴細胞亞群檢測也可用于急性白血病和淋巴瘤的初篩，能發現異常細胞及其表達的標志物。惡性腫瘤患者也存在免疫異常，外周血T淋巴細胞和NK細胞監測可提供一定的參考依據。目前，流式細胞術是公認的用于分析淋巴細胞亞群的“金標準”[7]，然而，由于進口流式試劑價格昂貴，且配貨周期長，因此如何選擇適合自己實驗室需求的國產流式試劑成為各臨床實驗室面臨的重要問題。為此，本研究對國產流式試劑的檢測性能進行了驗證。

本研究收集了3家實驗室的200例樣本，確保淋巴細胞亞群覆蓋低、中、高3個水平。結果顯示，國產流式試劑的CD3+細胞、CD8+細胞、CD19+細胞百分比及CD3+細胞、CD19+細胞絕對數檢測結果與進口流式試劑比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。但該差異僅能反映淋巴細胞亞群檢測結果均值或中位數的差異，無法反映數據的一致性。因此，還需通過分析檢測結果的一致性或可靠性來衡量這種差異造成的影響。ICC可用于評價不同測定方法或評定者對同一定量測量結果的一致性或可靠性，0表示不可信，1表示完全可信[8]，一般認為ICC＞0.74為可信度好。本研究2種流式試劑之間的r值和ICC值均＞0.9，可確認2種流式試劑檢測淋巴細胞亞群百分比和絕對數的一致性較好，結果具有可比性。在流式細胞分析中，陰、陽性抗原細胞的區分也十分重要，抗原陰性細胞或者碎片的背景熒光會影響結果的準確性，所以應選擇染色效果好的試劑。本研究結果顯示，雖然熒光抗體、細胞數量、染色時間、PMT相同，但是國產流式試劑與進口流式試劑SI的差異依然有統計學意義（P＜0.05）。這可能是導致2種試劑檢測淋巴細胞亞群百分比和絕對數存在差異的原因之一。本研究CD4+細胞的檢測結果與嚴艷等[9]結果一致。

目前，用于淋巴細胞亞群檢測的樣本的處理和結果分析還是通過人工完成，未實現全自動化，因此淋巴細胞亞群檢測的影響因素較多。在相同的儀器和試劑條件下，儀器的狀態（電壓、熒光補償、閾值設定等）、樣本前處理（加樣量不準、紅細胞裂解不完全等）、淋巴細胞散點圖分析方法等因素可能是淋巴細胞亞群檢測結果出現差異的主要原因。另外，試劑廠商熒光抗體的選擇也會對淋巴細胞亞群檢測結果產生影響。本研究使用的進口流式試劑和國產流式試劑均采用相同的熒光染料，但克隆號、免疫球蛋白亞型、抗體種屬、發射峰等的不同可能也會導致檢測結果出現差異。根據廠家試劑說明書，本研究使用的進口流式試劑與國產流式試劑中CD3的克隆號分別為SK7、UCHT1，CD8的克隆號分別為SK1、HIT8a，其他項目的克隆號未能查證。此外，患者的種族和抗原決定部位表達的個體差異也會對檢測結果產生影響[10]。由于目前我國流式細胞檢測結果的質量控制尚無統一的標準[11]，因此本研究參考《流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南》[4]進行偏移的比較，結果顯示，2種試劑檢測淋巴細胞亞群的結果偏移均在可接受范圍內。

綜上所述，國產流式試劑與進口流式試劑檢測淋巴細胞亞群的結果雖有一定的差異，但相關性和一致性均較好。各臨床實驗室可根據自己的需求來選擇合適的抗體試劑。