一種暹羅炭疽菌Colletotrichum siamense引起的棗炭疽病

解小鋒，楊緒強，亓玉昆，孟曉曄，韓鳳英，劉文璋，劉 慇，韓傳明，王清海

（1.山東省林業保護和發展服務中心，山東 濟南250014； 2.山東省濟南市長清區文昌林業站，山東 濟南250300； 3.山東省林業科學研究院，山東 濟南250014； 4.山東農業工程學院，山東 濟南250100）

棗（Zizyphus jujuba Mill.），鼠李科、棗屬，果肉甘甜味美，汁多果脆，富含豐富的維生素和礦物質元素，被譽為“天然維生素丸”。棗為中國特有樹種，在我國具有悠久的栽培歷史。棗樹適應性廣、抗逆性強，在我國新疆及黃河中下游流域均有分布。 近年來，隨著栽培模式的升級、品種的更新換代，我國棗栽培面積及產量穩步增長，2019年我國棗產量達746.4 萬t。

由炭疽菌屬（Colletotrichum sp.）真菌引起的炭疽病是棗產區的一種重要植物病害，造成嚴重的經濟損失[1]。僅2007年，棗炭疽病在山西省柳林、晉中地區造成了14 億元的損失[2]。 炭疽菌屬真菌全球性分布，危害寄主范圍廣，尤其危害鱷梨、芒果等高檔水果，造成的經濟損失嚴重。 國內已有的報道表明棗炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）[1,3-8]，在棗炭疽病菌鑒定方面，大多數文獻依靠形態學特征，少量文獻通過形態學特征和ITS 序列分析相結合的方法。目前研究表明，膠孢炭疽菌是一個復合種[9]，是否有其他炭疽菌可以引起棗炭疽病，尚不清楚。

2019年8月，作者在山東省濟南市仲宮鎮小門牙村棗園調查時，發現棗葉（品種：仲秋紅）上出現圓形或不規則形褐色病斑，病葉率達30%以上，感病棗樹樹勢較弱。 因此完全有必要明確其病原種類，為該病的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病棗葉片，2019年8月，從山東省濟南市仲宮鎮小門牙村棗園采集。

1.2 方法

1.2.1 棗炭疽病菌株分離純化

樣品分離采用常規的組織分離方法。 采集的棗炭疽病病葉70%乙醇表面處理后，在葉片病健交界處，用無菌的解剖刀切成小組織塊（5 mm×5 mm）。 然后依次1%次氯酸鈉（1 min），70%乙醇溶液（1 min），無菌水沖洗3 次。將處理后的小組織塊置于PDA 平板上（5 塊/皿），28℃，散光條件下培養。5d 后，挑取單個菌落菌絲，置于新的PDA 平板上，散光條件下28℃培養7 d，在接種點附近產生橘紅色分生孢子團，用移菌環刮取少量孢子置于無菌水中，配成孢子液，在PDA 平板上涂布、培養。2d 后挑取單個菌落，獲得純化菌株。獲得純化菌株均在山東省林業科學研究院森林保護研究所保存。

1.2.2 致病性測定

獲得單孢菌株致病性通過離體接種的方法進行測定。 選取成熟、新鮮、健康的棗葉（品種：‘仲秋紅’），自來水沖洗30 秒，自然晾干，75%的酒精消毒處理，備用。 隨機選取JNZG11、JNZG311、JNZG313 菌株在PDA平板上培養7d，制成孢子懸浮液（×106孢子/mL），備用。 用無菌針（φ = 0.5 mm）輕微刺傷葉片，在傷口處接種200 μL 孢子懸浮液，以無菌水為對照。 將處理后的棗葉置于含有少量無菌水的無菌燒杯中，用保鮮膜封閉，28℃，培養7 d，觀察葉片的發病情況，并與田間癥狀進行比較。

1.2.3 病原鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定

選取JNZG11、JNZG311、JNZG313 菌株作為代表性菌株， 置于PDA 平板培養（28 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗）培養5 d，觀察記錄菌株的培養特征。5d 后挑取菌落產生的子實體（黑色小粒點），制作玻片，通過尼康50i顯微鏡（Nikon Eclipse 50i，日本）、QImaging 照相系統（QImaging 加拿大）、cellSens 軟件，觀察分生孢子及附著胞形態并測量其大小。

1.2.3.2 分子鑒定

采用改進的CTAB 法提取供試菌株的DNA[10]。 選取以下6 種保守基因進行擴增與測序，分別為：核糖體轉錄間隔區序列（ITS）、幾丁質合成酶A 基因（CHS-1）、肌動蛋白基因（ACT）、β-微管蛋白基因（TUB2）、3 -磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）和鈣調蛋白基因（CAL）為目的基因。 以ITS1/ITS4、CHSⅠ-79F/CHSⅠ-354R、ACT-512F/ ACT-783R、βt2a/βt2b、GDF-1/ GDR1、CL1/ CL2 分別為ITS、CHS-1、ACT、TUB2、GAPDH和CAL 基因的引物進行擴增測序。 擴增反應體系25 μL（Taq 酶mix 12.5 μL，上游引物下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL）。 PCR 參數：預變性（95°C，5 min）、變性（94°C，30 s）、退火（ITS:58°C，30 s；CHS-1、GAPDH: 56°C，30 s；ACT、TUB2、CAL: 59°C，30 s；）。 PCR 產物送往上海派森諾生物科技有限公司進行雙向測序。

將各個菌株 （JNZG11*、JNZG12*、JNZG14*、JNZG15*、JNZG311*、JNZG313*） 的ITS、ACT、CHS-1、GAPDH、CAL 和TUB2 基因序列提交到GenBank數據庫中 （基因編號：ITS: MT570098、MT570094、MT570096、MT570095、MT570093、MT570097；ACT: MT894282、MT894284、MT894293、MT894288、MT894289、MT894292；CHS -1: MT894270、MT894271、MT894272、MT894273、MT894274、MT894275；TUB2: MT894280、MT894276、MT894278、MT894277、MT894281、MT894279；GAPDH：MT894283、MT894287、MT894285、MT894286、MT894290、MT894291；CAL:MT894268、MT894264、MT894266、MT894265、MT894269、MT894267）。選取Colletotrichum gloeosporioides 復合種內的43 株菌株作為參考菌株[11]，以C.boninense 模式菌株MAFF 305972 為外圍菌株。 通過MEGA 7.0 軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建多基因（ACT-CHS-1-GAPDHITS-CAL-TUB2）系統發育樹，以自展法（Bootstrap）進行檢測（循環1000 次）。

2 結果與分析

2.1 棗炭疽病癥狀

2019年8月， 作者在山東省濟南市仲宮鎮小門牙村棗園調查時發現棗樹葉片受害嚴重， 病葉率達到30%以上。 危害棗樹葉片， 在葉片形成圓形或近圓形斑點，病斑中央褐色，凹陷，輪紋狀排列小黑點，四周黑褐色，病斑外圍有淡黃色暈圈。 葉脈對病斑擴展限制作用隨著病斑擴大， 幾個病斑擴展成不規則形壞死斑，部分壞死斑脫落，中央形成穿孔（圖1），嚴重影響葉片光合作用，后期造成葉片早落。

圖1 棗炭疽病田間癥狀Figure 1 Disease symptom on leaves of jujube in field

2.2 離菌株致病性

棗葉片接種孢子液5 d 后， 在葉片接種部位均表現出癥狀，發病率為100%（圖2a），而接種無菌水的葉片未表現出癥狀（圖2b）。葉片病斑圓形或近圓形， 中央稍微凹陷，黑褐色。 病斑擴大成近圓形或不規則形的壞死斑，壞死斑有黑色小粒點（子實體）產生，少量橘紅色粘質（分生孢子）（圖2a）。接種后產生的癥狀與田間觀察的癥狀一致。 通過同樣的分離方法，從接種產生的壞死斑上可以分離到與接種菌株形態特征一致的菌株。 由此可見，本試驗分離獲得的菌株可以引起棗炭疽病，是其病原菌。

圖2 致病性試驗(a)果實接種后病斑；(b) 對照Figure 2 Pathogenicity test (a) necrotic lesions on leaves inoculated with isolate JNZG313; (b) control with sterile water

2.3 棗炭疽病菌形態學鑒定

在PDA 培養基上，菌絲初期白色，菌絲致密，菌落平整，邊緣整齊。 后期逐漸形成淡黃色，背面色素黑褐色（圖3a）。分生孢子單胞無色，內含油滴、紡錘形至橢圓形（圖3b），大小為(11.1-) 12.7-13.3 (-17.8) ×(-4.4)5.2-5.5 (-6.3) μm (13.0 ±1.2 × 5.3 ± 0.5 μm, n = 50)，長寬比為2.5。 附著胞卵圓形、不規則形，深褐色（圖3c），大小為(7.3-) 8.6-9.2 (-9.8) ×(-5.1) 5.8-6.9 (-7.0) μm (= 8.9±0.7×6.3±0.7 μm, n=50)，長寬比為1.4。 通過觀察發現JNZG311 JNZG313 產孢較多，JNZG11 產孢較少。 其分生孢子附著孢大小、菌落形態與膠孢炭疽菌復合種(Colletotrichum gloeosporioides complex)形態學特征一致。

圖3 Colletotrichum siamense 形態特征（a）菌落形態；（b）分生孢子；（c）附著胞Figure 3 Colletotrichum siamense (a) cultural character； (b) conidia； (c) appressoria

2.4 棗炭疽病病菌多基因序列分析

將獲得的6 株菌株的6 個基因序列串聯后， 與暹羅炭疽菌模式菌株ICMP 18578 相似度為99.6%。 在采用最大似然法構建的多基因（ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、CAL、TUB2）系 統發育樹（圖4）中，以粗體表示的為模式菌株， 在分支節點處標注自展率， 標尺指示為0.02 步變化。 系統發育樹最高對數似然值為-8965.61。 本試驗獲得的6 株菌株（JNZG11*、JNZG12*、JNZG14*、JNZG15*、JNZG311*、JNZG313*）聚在暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）進化分支上（自展率94%）。

圖4 利用最大似然法基于棗炭疽病菌ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、CAL和TUB2 的基因數據構建的系統發育樹。 （自展率標于節點處，所用模式菌株由粗體表示，以Colletotrichum boninense MAFF305972 為外圍菌株，標尺指示0.02 步變化。 ）Figure 4 Phylogenetic tree of isolates of red-fleshed apple anthracnose with allied taxa calculated with sequence data of concatenated ACT,CHS-1, GAPDH, ITS, CAL, and TUB2 using maximum likelihood method (1,000 bootstrap replicates; bootstrap values indicated at nodes, the highest log likelihood =-8965.61).

結合分離菌株的形態特征、培養性狀、多基因系統發育分析以及致病性測定，明確了暹羅炭疽菌可以引起棗炭疽病。

3 結論與討論

炭疽菌屬植物真菌1790年首次發現，1831年建立炭疽菌屬，距今已有230 余年的歷史，其分類一直比較混亂。依靠形態特征、寄主范圍為主的分類系統，以及ITS 序列對復合種內的近源種不能有效區分。 直到2009年Cai et al 提出了利用多基因系統發育分析結合形態學并輔助其它鑒別手段的綜合方法，逐漸被接受，成為目前比較權威規范的炭疽菌分類方法。 棗炭疽病是棗樹生產中常見的一類重要的植物真菌病害， 國內已有的報道認為其病原為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides），其分類依據主要依靠形態學特征或輔以ITS 序列分析。 本實驗通過感病棗葉樣本組織分離、 單孢純化、致病性測定，表明分離獲得單孢菌株均可以引起棗炭疽病。 通過對分離菌株ITS、CAL、TUB2、GAPDH、ACT、CHS-1 等多基因系統發育分析， 結合形態特征、 培養形狀， 確定分離獲得菌株為暹羅炭疽菌（C.siamense）。 本次研究結果首次明確了暹羅炭疽菌可以危害棗（Z.jujuba），引起炭疽病，這與已有的棗炭疽病原種類報道不同。

近年來，國內外學者在蘋果、核桃、芒果、草莓、辣椒[12]等寄主上發現多種炭疽菌侵染危害。隨著炭疽菌屬真菌研究的深入，越來越多的研究證明確實存在多種炭疽菌侵染同一寄主的現象。 臺灣青棗（Z.mauritiana）炭疽病病原已被證實存在果生炭疽菌 （C.fructicola） 和暹羅炭疽菌（C.siamense）等2 種病原菌[13]。 臺灣青棗又稱印度棗、毛葉棗，為鼠李科棗屬植物，與Z.jujube 均為棗屬，是否存在果生炭疽菌侵染危害Z.jujube，還有待進一步研究。 本次實驗受采樣地點和采樣數量的限制，僅分離獲得暹羅炭疽菌一個種，隨著今后采樣量的增加，是否會有其它炭疽菌或炭疽菌新種還有待進一步研究。

暹羅炭疽菌是Prihastuti et al （2009年）在泰國咖啡上首次發現，引起咖啡炭疽病[14]。 暹羅炭疽菌分布范圍廣，已在非洲、美洲、大洋洲、亞洲均有發現[15-18]。 隨著對暹羅炭疽菌的關注，危害寄主的種類范圍越來越廣，本研究首次發現暹羅炭疽菌侵染棗引起炭疽病，棗是其新寄主。 因此，在棗炭疽病研究及制定防控方案時，暹羅炭疽菌同樣是不可忽視的。 目前，有關暹羅炭疽菌引起的棗炭疽病的發生流行、種群結構以及有效的防治措施還有待進一步研究。