晉谷21號成熟胚再生體系的優化

王玉玲，張世芳，尹藝臻，馬春英，王育選，劉清麗，趙 娟

（1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；2.遼寧農業職業技術學院，遼寧 營口 115009）

谷子（Setaria italica）又稱為粟，是禾本科狗尾草屬最古老的作物之一[1]。谷子因兼具水分利用率高、抗旱性強、耐瘠薄等特性，是北方旱作生態農業建設的主體作物和應對未來日益變暖氣候及干旱生態環境的戰略儲備作物，在目前的種植業結構調整中起著重要作用[2]。由于建立穩定高效的再生體系是分子、遺傳等相關研究在谷子上開展應用的前提條件和關鍵環節[3-4]，已建立多個谷子品種的離體再生體系，并開展了不少關于谷子轉基因、突變體誘變和篩選等工作，但與水稻（Oryza sativaL）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等模式植物相比，谷子離體再生和遺傳轉化效率還比較低，且在不同品種間存在明顯差異，需要針對特定品種進行離體再生體系培養方案的優化。

RAO等[5]用成熟胚作外植體培養獲得愈傷組織和再生植株，發現谷子不同基因型再生能力存在差異。國內較早的是許智宏等[6]利用谷子以及狗尾草的幼穗作外植體成功誘導植株再生。王節之等[7]研究了常用激素對谷子幼穗組培的影響，探索出了幼穗愈傷誘導和植株再生的較理想的激素配比。王寒玉[8]對谷子成熟胚莖尖進行了愈傷誘導并優化了培養條件，發現晉谷21號等4個谷子品種均有較強的愈傷誘導率，但沒有對愈傷的分化進一步研究。袁進成等[9]對不同谷子品種成熟胚作了愈傷誘導和分化研究，發現成熟胚再生能力對基因型有很大依賴。李惠[10]以晉谷21號為材料，建立了谷子幼穗的離體再生體系，并對谷子成熟胚進行了愈傷組織的誘導研究，但誘導率和分化率都較低。

晉谷21號米質優異，抗旱性強、抗谷瘟病、高抗銹病，是目前種植面積最大的優質米開發品種，加強晉谷21號遺傳和組織培養研究對谷子優質育種至關重要。雖然前期試驗已經初步建立晉谷21號成熟胚愈傷組織再生體系，但存在愈傷組織誘導不穩定、誘導率和分化率較低等問題。本試驗在前期研究基礎上，從多方面對晉谷21號成熟胚愈傷組織誘導及植株再生體系進行優化，以期建立晉谷21號成熟胚愈傷組織誘導和分化體系，為晉谷21號遺傳改良提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

晉谷21號谷子（Setaria italica）（登記編號：GPD谷子（2017）140009），由山西農業大學經濟作物研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 成熟胚滅菌 取晉谷21號種子用砂紙輕輕打磨剝去谷殼，挑選飽滿無損傷去殼種子，用流水沖洗20 min，無菌水沖洗2次，75%乙醇浸泡30 s后，轉至20%NaClO溶液浸泡20 min，期間不斷振蕩，無菌水沖洗4次，置于無菌濾紙上晾干后，接種于附加不同成分的培養基中，每培養瓶接種7粒種子，每個處理組接種12瓶。

1.2.2 愈傷組織誘導培養基的篩選 以MS+2.0 mg/L 2，4-D為基本培養基，添加不同種類和濃度的植物激素（KT、TDZ、6-BA、NAA、ABA）進行愈傷組織誘導（表1）。培養條件為溫度（25±1）℃，暗培養15 d。根據愈傷組織誘導率和誘導出愈傷組織的生長狀態篩選適宜的培養基。

表1 愈傷組織誘導培養基Tab.1 Callus induction medium

以上述試驗篩選出的最適培養基MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA為基本培養基，附加不同濃度的蔗糖和Ag NO3進一步優化愈傷組織誘導培養基（表2）。

表2 附加蔗糖和Ag NO3的愈傷組織誘導培養基Tab.2 Callus induction medium supplemented with sucrose and Ag NO3

1.2.3 愈傷組織繼代 誘導出愈傷組織后，以MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+5.0%蔗糖 和MS+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+5.0%蔗糖為愈傷組織繼代培養基，分別以帶種子和切除種子2種方式對愈傷組織進行繼代培養。

1.2.4 愈傷組織分化 采用L25（56）正交表設計試驗，試驗因素為蔗糖、瓊脂、PP333（表3）。以前期王曉璐等[11]篩選出的MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為基本培養基，在其中加不同濃度蔗糖、瓊脂、PP333，將愈傷組織接種至25種分化培養基上（培養基編號為1~25號，CK為對照）。光照時間為16 h/d，光強2 000 lx，培養35 d后調查愈傷組織分化情況，統計分化率。

表3 L25（56）愈傷組織分化正交試驗設計Tab.3 Orthogonal experiment design of L25（56）callus differentiation

1.2.5 分化苗生根 分別以MS、1/2 MS（大量和微量減半）和MS+1.0 mg/L NAA為生根培養基，將生長健壯的分化苗接種到培養基上，培養28 d后，觀察分化苗的生根情況。

1.3 數據分析

采用Excel 2013軟件進行數據統計，用SPSS 19.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同激素對谷子愈傷組織誘導的影響

晉谷21號種子接種到誘導培養基上3 d后可見愈傷組織開始發生，但生長緩慢，7 d后生長加速。各培養基均可誘導愈傷組織產生，但晉谷21號種子誘導率和愈傷組織生長狀態在不同培養基中差異明顯。

不配比任何細胞分裂素時，誘導率為82.14%，誘導出的愈傷組織白色透明、呈黏稠狀，后經分化培養不能獲得分化苗（圖1）。培養基中配比3種細胞分裂素（KT、TDZ、6-BA）后，愈傷組織分化率隨每種激素附加濃度不同發生變化（圖2）。配比6-BA時以0.2 mg/L誘導率最高，為91.67%，且愈傷組織生長旺盛，顏色淡黃致密，質量好，經分化培養可獲得分化苗；配比KT時以0.5 mg/L愈傷組織誘導率最高，為83.33%，誘導出的愈傷組織呈乳白色，結構略松散；添加TDZ時以0.1 mg/L愈傷組織誘導率最高，為88.1%，略低于添加6-BA，誘導出的愈傷組織較添加KT的更致密，經分化培養也可獲得分化苗?？梢姡c細胞分裂素配比比單獨附加2，4-D誘導愈傷組織效果更好，KT、TDZ、6-BA在各自適宜濃度提高了愈傷組織誘導率，且明顯改善了愈傷組織質量。

不同質量濃度NAA與2，4-D復配時并未明顯提高誘導率。在不同復配方案中，不添加NAA，誘導率最高，其次是添加0.4 mg/LNAA，誘導率為80.95%，且誘導出的愈傷組織生長量小，增殖緩慢，顏色偏暗黃，可見，單獨附加2，4-D效果優于其與NAA復配使用。

培養基中添加不同質量濃度ABA后，可顯著提高愈傷組織誘導率，ABA濃度為0.4 mg/L時誘導率最高，達95.24%，且誘導出的愈傷組織色白致密，但與培養基中添加0.2 mg/L 6-BA相比，在相同培養期內，其生長緩慢，增殖量小。

綜上，兼顧愈傷組織誘導率和生長狀態，晉谷21號愈傷組織誘導培養基添加激素以MS+2.0 mg/L 2，4-D中添加0.2 mg/L 6-BA為好，0.1 mg/L TDZ次之，其可作為6-BA的替換激素。

2.2 蔗糖和AgNO3對谷子愈傷組織誘導的影響

由圖3可知，隨著培養基中蔗糖濃度升高，晉谷21號種子愈傷組織誘導率呈先增后降的趨勢，附加蔗糖濃度為5%時，愈傷組織誘導率達最高，為95.24%。愈傷組織呈亮黃色致密結構，且生長速度快，增殖量大且質地好，質量明顯優于原培養基中添加3%蔗糖處理。

由圖4可知，培養基中添加Ag NO3后，也可明顯提高愈傷組織誘導率，Ag NO3質量濃度為5 mg/L時達到最高（96.43%），誘導出的愈傷組織呈淡黃色或淺白色，較為致密，但其生長速度較為緩慢，相同培養期內，其生長量明顯小于不添加Ag NO3的培養基。故晉谷21號種子愈傷組織誘導的適宜培養基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+5.0%蔗糖，誘導率較之前提高了2.38百分點，有利于進一步的分化。

2.3 繼代培養對愈傷組織生長的影響

為探究影響愈傷組織繼代過程中的因素，將誘導出的愈傷組織在不同培養基、不同繼代方式下（帶種子和不帶種子）進行繼代培養。由表4可知，在設定的2種培養基中，帶種子繼代和不帶種子繼代對愈傷組織的生長沒有明顯影響，均隨著繼代時間的延長出現生長緩慢、褐化現象。由圖5可知，繼代培養7 d后，愈傷組織生長良好；培養14 d后部分愈傷組織出現水質化、邊緣褐化；培養21 d后愈傷組織大多發生嚴重褐化?？梢?，不同培養基和繼代方式對愈傷組織的質量影響不大，繼代培養時間周期是影響愈傷組織生長的主要因素，所以，晉谷21號谷子愈傷組織繼代培養時間以不超過14 d為宜。

表4 繼代后愈傷組織生長變化情況Tab.4 Changes of callus growth after subculture

2.4 蔗糖和不同添加物對愈傷組織分化的影響

由表5、圖6可知，在含不同成分的25組培養基中，愈傷組織的分化率及分化苗的生長情況存在較大差異。其中，25號培養基分化率最高，為28.33%，較對照提高了8.33百分點，且分化苗生長健壯；其次為13號和20號培養基，分化率均為26.67%（較對照提高了6.67百分點），但分化苗的生長情況不同，13號培養基中分化健壯，苗最高可達6 cm左右,20號培養基中分化苗矮壯，苗高2~3 cm，其他培養基中的愈傷組織分化率部分低于對照，最低僅為5.00%，但分化苗普遍比對照生長旺盛。由愈傷組織分化率及分化苗生長狀態篩選出3種適宜晉谷21號愈傷組織分化的培養基，即25號（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3.0%蔗糖+14 g/L瓊脂+3.0 mg/L PP333）、20號（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.5%蔗糖+14 g/L瓊脂+4.0 mg/L PP333）和13號（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0%蔗糖+10 g/L瓊脂+4.0 mg/L PP333）,其中25號培養基分化率最高。對比其他培養基可知，篩選出的這3種培養基均提高了瓊脂和PP333用量，尤其附加較高濃度的PP333可以明顯促進晉谷21號愈傷組織的分化，且在提高分化率的同時獲得生長健壯的分化苗。因此，在愈傷組織分化培養基中添加1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA、3.0 mg/L PP333、3.0%蔗糖、14 g/L瓊脂分化率最高，較之前提高了15百分點，且分化出的谷苗健壯。

2.5 不同種類培養基對分化苗生根的影響

將長勢良好的分化苗接種到MS、1/2 MS（大量和微量減半）和MS+1.0 mg/L NAA等3種培養基上培養21~28 d后，培養基中所有分化苗均可生根，但生根情況有所不同。由圖7可知，在MS培養基中，分化苗根系黃白較細，分化苗長勢一般；而在1/2 MS和MS+1.0 mg/L NAA 2種培養基上較MS生出的根更壯，分化苗長勢也更好，尤其是在1/2 MS培養基上，根黃白也最粗壯，分化苗長勢最好，可用于移栽。在MS+1.0 mg/L NAA中，谷苗生根良好，但在生根過程中谷苗易發生部分褐化。所以，選擇1/2 MS培養基為晉谷21號最適生根培養基。

3 討論

3.1 不同激素對谷子愈傷組織誘導的影響

植物激素對培養物的生長和分化起著重要調控作用，是愈傷組織誘導、分化和生根等培養過程中最主要的篩選因素。大量研究結果表明，2，4-D對誘導愈傷組織效果好，王曉璐等[11]的試驗結果也證實了這一觀點，也初步篩選了其與6-BA配比使用的情況，但未對其他細胞分裂素進行篩選。本試驗中，分別用KT、TDZ和6-BA與2，4-D配比添加，發現在附加不同種類和濃度細胞分裂素的培養基上愈傷組織誘導率和生長狀態不同，但配比添加總體優于2，4-D單獨添加，KT、TDZ、6-BA在各自適宜濃度提高了愈傷組織誘導率，且明顯改善了愈傷組織質量。其中，以配比低質量濃度0.2 mg/L 6-BA為最好，愈傷組織生長速度快，增殖量大且結構致密，后經分化培養，可獲得優質分化苗。宗越等[12]對毛建草愈傷組織誘導的研究表明，6-BA濃度高時容易造成毛建草莖段的褐變死亡,導致愈傷組織的誘導率降低，這與本試驗結果一致。配比0.1 mg/L TDZ也可獲得胚性愈傷組織，但誘導率略低于6-BA，可作為6-BA的替換激素添加。多種作物的離體培養研究表明，在培養基中附加ABA可以提高愈傷組織質量[13-14]。本試驗發現，在培養基中添加適量ABA可明顯提高晉谷21號愈傷組織誘導率和質量，但相同培養期內愈傷組織生長量會減少，建議根據具體試驗時對愈傷組織的要求選擇是否添加ABA。有研究表明，不同種類生長素復配使用誘導愈傷組織，可提高愈傷組織質量[15]。本試驗中以2.0 mg/L 2，4-D與低濃度NAA復配誘導谷子種子愈傷組織，結果發現復配使用效果不佳，不僅誘導率降低，誘導出的愈傷組織質量也較差。

3.2 蔗糖和AgNO3對谷子愈傷組織誘導的影響

蔗糖在組織培養中起到提供碳源和調節滲透壓的作用。有研究表明，用高濃度蔗糖預處理水稻愈傷組織，調節細胞滲透壓，可以提高細胞質濃度，能夠在超低溫過程中有效保護細胞結構，避免細胞毒害作用[16]。本試驗表明，提高培養基中蔗糖濃度可顯著提高愈傷組織誘導率，且愈傷組織增殖快，增殖量大，質地緊實，胚性強，這與STRATUS[17]的研究結果一致。Ag+是乙烯的強烈抑制劑，有關Ag NO3在組織培養中的作用報道結果不一。袁進成等[18]研究表明，適宜濃度的Ag NO3可以促進冀谷11號愈傷組織的誘導和分化，而趙虹[19]在小麥基因槍轉化體系的建立試驗中發現，其作用效果并不明顯。本試驗表明，培養基中添加少量Ag NO3可提高晉谷21號愈傷組織誘導率，但誘導出的愈傷組織生長緩慢慢，增殖量少。

3.3 繼代培養對愈傷組織生長的影響

繼代培養也會影響愈傷組織的胚性。周杰[20]研究表明，繼代培養可以提高秈稻成熟胚愈傷組織的胚性。李雙成等[21]研究發現，一些秈稻成熟胚愈傷組織經第1次繼代后就全部褐化。本試驗發現，晉谷21號愈傷組織以不同培養基帶種子或不帶種子進行繼代培養后，胚性沒有明顯變化，但隨著培養時間的延長愈傷組織會逐漸發生褐化，故其適宜的繼代培養周期為不超過14 d為宜。

3.4 蔗糖和不同添加物對愈傷組織分化的影響

愈傷組織分化率較低，是前期試驗初步建立晉谷21成熟胚愈傷組織再生體系遇到的另一個關鍵問題。本試驗在優化愈傷組織誘導培養基提高其誘導率和質量的同時，對蔗糖和2種附加物（瓊脂、PP333）進行篩選，以促進愈傷組織分化，提高分化率。有研究表明，對愈傷組織進行適當干燥處理后，可改善其狀態和質量，提高分化率[17]。本試驗中將培養基瓊脂濃度由6%提高到14%，起到干燥處理的作用，促進了晉谷21號愈傷組織分化，這與趙虹[19]、米慶莉等[22]、趙成章等[23]的研究結果一致。水稻、大麥、玉米等作物上的研究結果表明，培養基中添加適量PP333可促進愈傷組織分化，且獲得的分化苗生長旺盛、抗逆性強[24-26]；楊彩梅等[27]研究發現，低濃度PP333處理也可使唐菖蒲愈傷組織分化芽的數量明顯增加；薛寒青等[28]研究發現，采用PP333處理的切花百合試管苗苗質優于對照。本研究表明，分化培養基中添加適量多效唑可顯著提高愈傷組織的分化率和分化苗的質量。

3.5 不同類型培養基對分化苗生根的影響

谷子分化苗易生根，ANJALI等[29]研究表明，以不同濃度的萘乙酸（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）和芐基氨基嘌呤（0、1.0 mg/L）誘導生根，在不含植物激素的MS培養基上，繼代培養10 d后生根效果最好，MS培養基中生長素或細胞分裂素的存在完全抑制了根系的誘導。智邵川等[30]通過對構樹進行不同培養基的培養，結果表明，適當降低培養基大量元素濃度有利于構樹生根，各培養基培養效果表現為培養基1/2 MS>1/4 MS>MS。本試驗中，谷子分化苗在3種培養基上均可生根，但在1/2MS培養基中效果最好，這與上述研究結果基本一致。

4 結論

本研究選用晉谷21號成熟胚為試驗材料，在試驗中配比使用不同種類、濃度植物激素，添加不同濃度蔗糖和附加物來優化培養方案，最終確定了晉谷21號各階段的最適培養基和激素濃度。誘導愈傷組織的最適培養基為：MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L6-BA+5.0%蔗糖，誘導率為95.24%，較前期王曉璐等[11]提高了2.38百分點；愈傷組織分化的適宜培養基有3種，分別為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L PP333+2.5%蔗糖+14 g/L瓊脂，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3.0 mg/L PP333+3.0%蔗糖+14 g/L瓊脂和MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L PP333+2.0%蔗糖+10 g/L瓊脂，分化率最高為28.33%，較前期提高了15百分點，在這3種培養基中愈傷組織分化率高且分化出的谷苗生長健壯；最適生根培養基為1/2 MS。本研究對晉谷21號成熟胚組織培養（包括誘導愈傷、繼代、分化和生根培養）進行了優化，建立了完整、優良的谷子優質品種晉谷21號成熟胚的組織培養和再生體系，為晉谷21號的深入遺傳研究奠定了技術基礎。