基于微衛星標記的山西糜子資源DNA二維碼創建

楊 哲，陳 凌，王海崗，王瑞云，，喬治軍

（1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 農業基因資源研究中心/農業農村部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室/雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031）

糜子（Panicum miliaceumL.）屬禾本科黍屬[1]1年生禾谷類作物，耐瘠薄、早熟和抗旱，原產于我國，為北方旱地可持續農業主栽作物[2]。糜子作為最古老的作物之一，已有1萬年的耕作歷史[3]。全世界糜子種植面積約600萬hm2，在非洲、亞洲中部、東歐和北美等地都有分布[4]。糜子具有很高的能量和蛋白質，營養豐富，與小麥、玉米和水稻相比，富有大量的鐵、鉀、鎂、鈣、鋅、磷、多肽類和人體必需氨基酸，同時還是黃酒的制作原料，對糜子研究的深度和廣度日益加強[5]。糜子具有豐厚的抗旱基因，運用基因工程手段發掘和克隆其抗旱基因，可用于改進其他農作物的遺傳性狀。糜子在干旱脅迫下會在形態、生理等方面形成適應機制,抗旱基因在干旱脅迫下表達受阻，復水之后表達量明顯提高[5]。糜子富含對健康有益的化合物，如卵磷脂對人體神經系統起保健作用，可以緩解人體衰老，預防老齡化疾病的發生[6]。

全球糜子種質資源有20 000多份，我國目前保存有8 800多份，從分子水平準確評價其遺傳多樣性，有利于合理開發利用，提高糜子作物的品質，促進育種工作方面的研究[7]。隨著種質資源的不斷采集與引進，2003年DNA條形碼首次提出，對種質資源區別鑒定技術日趨完善，對大量的種質資源數字化和網絡化管理及種質間資源的親緣關系對比更加快捷方便。陳昌文等[8]篩選來自桃8條染色體的16對微衛星引物，最終構建了237份桃品種資源的分子身份證；趙艷杰等[9]利用40對微衛星引物構建了182份東北地區大豆品種的DNA指紋庫；高運來等[10]篩選獲得9對引物，構建了黑龍江省83份大豆品種的分子身份證；楊陽等[11]用17對微衛星引物構建了36個茶樹品種的分子身份證；李紅琴等[12]逐級篩選，最終確定23對微衛星引物，構建了青海省66份小麥品種的分子身份證。馬琳等[13]通過篩選確定7對微衛星標記，構建了130份甘藍型油菜品種的分子身份證。

糜子的研究多為糜子育種栽培，基于微衛星標記的分子身份證少有研究。本研究利用微衛星引物篩選技術對21份山西糜子種質資源進行遺傳多樣性評價，構建糜子種質資源的DNA二維碼，利用糜子種質資源的遺傳多樣性與地理環境分布特征，為優異種質資源鑒定、保護提供技術支撐，為糜子起源演化和傳播提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試21份糜子種質資源（表1），來源于山西不同糜子生態栽培區。

表1 21份糜子試驗材料Tab.1 21 broomcorn millet materials tested

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測 使用改進的CTAB法提取糜子基因組DNA，檢測其純度、質量和濃度后，稀釋10倍。

1.2.2 PCR擴增 采用BIO-GENER基因擴增儀進行擴增，反應體系：1.6μL dNTPs、7.4μL dd H2O、0.8μL引物（最終濃度為0.4μmol/L）、10μL 2×MasterMix和1μL DNA模板。聚合酶鏈式反應擴增過程為：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，50 s退火，72℃延伸60 s，進行36次循環；72℃延伸10 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 聚合酶鏈反應擴增產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，使用濃度0.1%硝酸銀銀染。

1.3 數據分析

根據對PCR擴增的條帶數據進行讀取基因組數據，有條帶的讀取“1”，無條帶的讀取“0”，并將數據轉換成不同格式，以適應不同軟件計算試驗參數，利用PowerMarker 3.25和MEGA 5.0等軟件分別計算引物的PIC及遺傳多樣性參數。使用東北農業大學分析軟件ID Analysis 4.0構建DNA分子身份證。輸入相應的字符串并使用網絡中的在線條形碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php）即可生成DNA條形碼分子身份證；將糜子種質材料的基本信息與身份證輸入在線二維碼技術（https://cli.im/）生成DNA二維碼分子身份證。

2 結果與分析

2.1 DNA的多態性及遺傳參數分析

利用21份糜子資源對四、五、六堿基引物共12對進行篩選，確定多態性高的引物用于分子身份證的構建。表2表明，四堿基重復多態性引物重復系列為：CTAG（6個）、CGAG（5個）、GGCC（5個）、TTGG（6個）、AGGA（6個）、CAGC（6個）、GATG（6個）共7種，其中，CGAG與GGCC最少。五堿基多態性引物堿基重復類型有CCTTT（5個）、ACACC（5個）、CGCGC（5個）、AATAG（5個），一共有4種（各占25%）。六堿基重復基序為TCATCT（6個），只有1種。有3對引物與其他引物相似系數過高，被剔除，剩余9對引物擴增結果清晰、穩定性好的引物，可作為候選核心引物用于構建糜子資源分子身份證。

從表3可以看出，21份材料在9個位點共檢測出等位變異27個，每個位點檢測到3個；有效等位基因數介于2.541 2~2.995 9，平均為2.841 2；多樣性指數介于0.995 8～1.097 9，平均為1.066 1；觀測雜合度介于0.529 4~0.888 9，平均為0.705 8；期望雜合度介于0.623 8~0.684 2，平均為0.664 6；Nei's期望雜合度（PIC）介于0.606 5~0.666 2，平均為0.646 9；多態性信息含量介于0.601 0~0.772 0，平均為0.707 6。綜上所述，9個引物的PIC值都大于0.5，可用于構建DNA二維碼。

表2 多態性微衛星引物堿基重復基序Tab.2 Base repeat motifs of polymorphic microsatellite primers

表3 核苷酸重復性遺傳參數Tab.3 Genetic parameters of nucleotide repeatability

2.2 糜子資源DNA條形碼與二維碼構建

將21份糜子種質的字符串導入到條形碼生成器中，得到DNA條形碼。將糜子種質的名稱、統一編號、來源和身份證號信息輸入在線二維碼生成器得到DNA二維碼（圖1）。

3 結論與討論

3.1 分子標記的選擇

隨著糜子作物全基因組測序技術的開展，構建覆蓋全基因組的高通量、易操作、高精度的DNA分子身份證已成為迫切需要解決的問題。DNA分子標記具有多態性高、重現性好、共顯性且覆蓋整個基因組等特點[14]。分子標記經歷了3個階段：（1）基于雜交的標記（RFLP）；（2）基于PCR的標記（RAPD、ISSR和微衛星等）；（3）基于單核苷酸的標記（SNP）[15]。近年來，分子輔助標記在物種鑒定上廣泛應用。在BMT測試指南草案中，國際植物種類保護聯盟把構建DNA指紋數據庫的標記確定為微衛星和SNP[15]。苑克俊等[16]利用6個微衛星標記構建杏系的分子身份證，對杏種質的保護提供參考。樊曉靜等[17]利用SNP標記建立茶樹品種的分子數據庫，為茶樹品種資源保護鑒定提供思路。本試驗基于糜子全基因組測序基礎上，分子標記方法同王瑞云等[18]和苑克俊等[16]，利用微衛星標記構建糜子品種資源的DNA二維碼。相比較RFLP標記需要同位素標記、一定數量的探針；RAPD等標記對試驗條件的嚴格要求；SNP高額的昂貴的試驗器材與試劑費用，微衛星標記只需預先設計引物，且檢測效果好，合成成本低。本研究基于9個微衛星標記構建21份糜子資源DNA二維碼，有利于品種資源的有效鑒別、區分。

3.2 DNA指紋圖譜與分子身份證編碼區別

DNA指紋圖譜是構建種質資源身份證的基礎，分子身份證與DNA圖譜功能相同。DNA圖譜可以區分作物個體間差異，而分子身份證可以實現DNA指紋數字化，使種質資源的檢索容易快捷[19]。與DNA圖譜相比較，分子身份證檢測更靈敏。目前，用微衛星標記構建分子身份證的編碼采用3種措施：（1）根據微衛星指紋圖譜，用0和1表示某個等位基因擴增DNA條帶的存在有無，并將微衛星指紋圖譜轉換為由0和1組成的字符串，即種質資源的分子身份證[20]。（2）等位基因賦值編碼類型，每對引物擴增的基因從小到大依次編碼，當有2個等位基因時，選擇堿基數較少的一個[20]。（3）基因型賦值編碼類型，將獲得的一系列帶型用單個數字進行編碼，依照固定引物串聯各帶型編碼，形成一組數據，即種質資源的分子身份證[21]。本研究采用的第1類措施編碼，該措施統計方便，書寫簡潔和字符串長短適中且易于檢索。

3.3 遺傳多樣性分析

隨著微衛星分子標記的深入研究，其廣泛應用為作物的遺傳多樣性評估提供了重要的分子檢測工具。劉笑瑜等[22]利用6對微衛星引物對我國糜子種質遺傳多樣性進行研究，多樣性指數（I）值為0.542 6和PIC值為0.340 3。董俊麗等[23]對國內外的96份糜子資源進行微衛星標記評估，共檢測出128個等位基因數，平均每個位點5.82個，I值為0.409 7，PIC值為0.392 0。王瑞云等[18]利用15個特異性微衛星對不同生態區的132份糜子資源進行遺傳多樣性的評價，共檢測到107個等位變異基因，平均各位點7個，I值和PIC值分別為0.529 8和0.486 4；寇淑君等[24]用22對微衛星引物對131份糜子材料進行遺傳多樣性評價，共檢測到128個等位變異基因，平均每個位點5.82個，檢測到I值為0.628 4，PIC值為0.587 4。本試驗采用微衛星標記進行遺傳多樣性分析，平均遺傳多樣性指數和PIC值分別為1.066 1和0.707 6，期望雜合度平均值為0.664 6，觀測雜合度平均值為0.705 8，說明糜子遺傳多樣性較高，均高于以往研究結果[18，22-24]，這與試驗材料的來源有關或與高基元引物較低、基元引物檢測精度高有關，與試驗材料的來源有關。雜合度反映的是群體內遺傳變異程度，觀測雜合度與陳小紅等[25]、王舒婷等[26]觀測雜合度相差不大，說明育種后代的親緣關系密切。等位基因數范圍無較大差異，但與王瑞云等[18]、董俊麗等[23]和寇淑君等[24]的觀測等位基因數相差較大，說明等位基因數的多少與引物多態性和樣品地理位置有關。