加味三核顆粒質(zhì)量控制研究*

李慧峰 孟 霜 馮振宇 周曉榮 王鑫鑫 裴妙榮※ 趙建平

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619；2.山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030013；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，山西 晉中 030619）

前列腺增生癥是引發(fā)中老年男性排尿障礙的一種常見(jiàn)良性疾病，在50 歲人群中發(fā)病率為40%，在80 歲以上人群中發(fā)病率接近90%，90 歲以后人群發(fā)病率幾乎100%。我們目前逐步進(jìn)入人口老齡化階段，前列腺增生癥患者逐年增加，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，甚至還可能傷及腎臟，造成腎功能不全等后果[1]。加味三核顆粒是國(guó)醫(yī)大師王世民教授由經(jīng)典古方加味而成，由橘核、山楂核、荔枝核、黃柏、水紅花子等多味中藥組成的中藥制劑，治療前列腺增生療效顯著，極大地減輕了患者的病痛。本論文就加味三核顆粒的薄層定性鑒別、含量測(cè)定、方法學(xué)考察進(jìn)行研究，建立加味三核顆粒的完整、全面的質(zhì)量控制方法，為加味三核顆粒的質(zhì)量控制研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國(guó)Waters e2695 高效液相色譜儀，Waters 2998 紫外檢測(cè)器，Empower 工作站；CAMAG TLC VISUALIZER 薄層成像儀；CAMAG LINOMAT 5 半自動(dòng)點(diǎn)樣儀；瑞士METTLERA B135-S 電子天平；SB-800 DTD超聲波清洗機(jī)。

1.2 試劑 乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201915）；黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)：121510-201807）；補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材（批號(hào)：121056-201605）；蛇床子對(duì)照藥材（批號(hào)：121030-201808），以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃柏的薄層鑒別 將樣品研磨成細(xì)粉狀，取3 g 于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲30 min 后過(guò)濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3 mL 分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣↑S柏對(duì)照藥材2.0 g，制備方法同供試品溶液，作為對(duì)照藥材溶液。再取黃柏陰性樣品3 g，制備方法同供試品溶液，即得缺黃柏的陰性對(duì)照溶液[2，3]。參照2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3 個(gè)批次供試品、黃柏對(duì)照藥材以及缺少黃柏的陰性對(duì)照溶液各吸取1 μ L，應(yīng)用薄層色譜點(diǎn)樣儀，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，點(diǎn)好的薄層板在內(nèi)含乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中展開(kāi)完全后，將薄層板從展開(kāi)槽中取出，通風(fēng)處晾干，在紫外光燈（366 nm）下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)批次供試品薄層色譜圖與黃柏對(duì)照藥材薄層色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃柏薄層色譜圖

2.1.2 補(bǔ)骨脂的薄層鑒別 將樣品研磨成細(xì)粉狀，取2 g于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲45 min 后過(guò)濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3 mL 分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣?.5 g 補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材、2 g 補(bǔ)骨脂陰性樣品分別制備對(duì)照藥材和缺補(bǔ)骨脂的陰性對(duì)照溶液，方法同上[3，5]。參照2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3 個(gè)批次供試品、補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材以及缺少補(bǔ)骨脂的陰性對(duì)照溶液各吸取2 μ L，應(yīng)用薄層色譜點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)置于同一個(gè)硅膠G 板上，點(diǎn)好的薄層板在內(nèi)含乙酸乙酯-正己烷（3∶1）展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中展開(kāi)完全后，將薄層板從展開(kāi)槽中取出，通風(fēng)處晾干，以10%氫氧化鉀甲醇溶液作為顯色劑，將其均勻的噴灑于展好的薄層板上，105 ℃ 恒溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)批次供試品色譜圖與補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂薄層色譜圖

2.1.3 蛇床子的薄層鑒別 將樣品研磨成細(xì)粉狀，取2 g 于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲40 min 后過(guò)濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加3 mL 分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣? g 蛇床子對(duì)照藥材、2 g 蛇床子陰性樣品分別制備對(duì)照藥材和缺蛇床子的陰性對(duì)照溶液，方法同上[3，5]。參照2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3 個(gè)批次供試品、蛇床子對(duì)照藥材以及缺蛇床子的陰性對(duì)照溶液各吸取2 μ L，應(yīng)用薄層色譜點(diǎn)樣儀分別點(diǎn)置于同一硅膠G 薄層板上，點(diǎn)好的薄層板在內(nèi)含二氯甲烷-乙酸乙酯-正己烷（2∶3∶2）展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中展開(kāi)完全后，將薄層板從展開(kāi)槽中取出，避光處晾干，在紫外光燈（366 nm）下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)批次供試品色譜圖與蛇床子對(duì)照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蛇床子薄層色譜圖

2.1.4 水紅花子的薄層鑒別 將樣品研磨成細(xì)粉狀，取3 g 于具塞錐形瓶中，加入20 mL 分析純甲醇，超聲波清洗機(jī)超聲30 min 后過(guò)濾取出，在水浴鍋上蒸干得到的濾液，加20 mL 蒸餾水溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤河?0 mL 的乙酸乙酯萃取2 次，合并并濃縮乙酸乙酯液，水浴蒸干萃取液，加1 mL 分析純甲醇溶解殘?jiān)蟮玫降娜芤杭礊楣┰嚻啡芤骸Ａ砣? g 水紅花子對(duì)照藥材、3 g水紅花子陰性樣品分別制備對(duì)照藥材和缺水紅花子的陰性對(duì)照溶液，方法同上[3，6]。參照2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》四部0502 通則[4]下薄層色譜法，將制備好的3個(gè)批次供試品、水紅花子對(duì)照藥材以及缺水紅花子的陰性對(duì)照溶液各吸取5 μ L，點(diǎn)于同一張聚酰胺薄膜上，點(diǎn)好的薄膜置于含氯仿-甲醇（3∶2）展開(kāi)劑的展開(kāi)槽中展開(kāi)完全后，將薄膜從展開(kāi)槽中取出，通風(fēng)處晾干，將10%三氯化鋁乙醇溶液均勻噴在薄膜上，在紫外光燈（366 nm）下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)批次供試品色譜圖與水紅花子對(duì)照藥材色譜圖在同一位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)顯現(xiàn)，圖譜顯色清晰，陰性對(duì)照未見(jiàn)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 水紅花子薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定[7，8]

2.2.1 色譜條件 固定相：Gemini C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μ m）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000 mL 加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.32 mg 的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例分別稱取除黃柏以外的其余藥味，按照加味三核顆粒的制備工藝制成陰性樣品，按2.2.3 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制作，制備成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μ L，按2.2.1 項(xiàng)下所述的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：陰性樣品溶液在鹽酸小檗堿的色譜峰位置上無(wú)吸收，表明該方法的專屬性良好。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 加味三核顆粒HPLC 色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品6.40mg，置10 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；再分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2 mL 至2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得不同濃度對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μ L，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，ng）作圖，得一直線回歸方程：Y＝2883.1X+44363，R2＝0.9996，r＝0.9998，故鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在640～6400 ng 進(jìn)樣范圍內(nèi)，濃度與色譜峰峰面積呈良好線性。

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（0.32 mg/mL）10 μ L，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積積分值，其RSD 為0.60%（n=6）。結(jié)果表明：該高效液相色譜儀的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液（批號(hào)20200820）在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進(jìn)樣10 μ L，測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿峰面積積分值，其RSD 為0.97%。結(jié)果表明：供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)20200820）的加味三核顆粒6 份，按3 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μ L，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中鹽酸小檗堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.9977 mg/g，RSD＝1.06%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量批次樣品（批號(hào)20200820，3.9977 mg/g）6 份，分別精密添加鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算回收率。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均回收率為100.56%，RSD 為1.46%，表明該方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本文采用TLC 法對(duì)加味三核顆粒中黃柏、補(bǔ)骨脂、蛇床子、水紅花子進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果供試品樣品與對(duì)照藥材相對(duì)應(yīng)的位置有相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，實(shí)驗(yàn)專屬性強(qiáng)，可以作為加味三核顆粒的定性鑒別方法。

黃柏是加味三核顆粒的君藥，其中鹽酸小檗堿為黃柏的主要藥效成分，故選擇鹽酸小檗堿作為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)性成分。實(shí)驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》一部、四部及文獻(xiàn)報(bào)道，采用HPLC 法對(duì)鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定。為獲得最佳的分離效果，依據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行條件摸索，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm[8]，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1 L 流動(dòng)相中加十二烷基苯磺酸鈉0.1 g）[4，9]。流動(dòng)相在配置的過(guò)程中先配置乙腈-0.1%磷酸溶液，再加十二烷基苯磺酸鈉，這樣操作可以避免大量氣泡的產(chǎn)生。本方法簡(jiǎn)便，容易操作，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于加味三核顆粒的質(zhì)量控制。