基于多數據庫分析HLA-DPB1在肺腺癌中的潛在價值

楊恒 張軍 郭強 林稱意 羅衛民 原野 程棟梁 羅湘玉 劉華 郭家龍

肺癌導致的死亡占所有腫瘤死亡的18.4%，是世界上最常見的腫瘤相關死亡原因[1-2]。據文獻估計，2020年肺癌死亡人數將占美國所有腫瘤死亡人數的首位，約22.38%[3]。肺癌發病早期臨床癥狀不明顯，部分確診時已為晚期，伴有縱隔淋巴結轉移甚至遠處轉移[4]。因此，肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)的早期診斷和有效治療對于病人獲得較好預后就顯得尤為重要[5]。近年來，腫瘤免疫和免疫治療在腫瘤的治療中受到重視，正逐漸成為癌癥治療的方向[6-7]。人類白細胞骯原-DPB1(HLA-DPB1)抗原常表達于免疫T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等表面，主要通過識別并結合相關肽分子向活化的CD4+T細胞提供免疫信息，促進其增殖和細胞毒性，從而在免疫系統中發揮重要作用[8-10]。本研究通過多個在線數據庫分析HLA-DPB1在LUAD發生發展和免疫浸潤作用，為LUAD的診斷、免疫治療和預后評價提供新型潛在靶點。

對象與方法

1.Oncomine分析：Oncomine數據庫(www.oncomine) 是一個基于基因芯片的數據庫和整合數據挖掘平臺，可直接在線訪問Oncomine數據庫，能幫助我們了解全基因組表達相關的研究[11]。本研究中Oncomine用于分析LUAD中HLA-DPB1的RNA水平。篩選條件：P<0.0001；倍數變化=1.5；數據類型為mRNA；分析類型:癌組織 vs正常組織。

2.Timer數據庫：Timer數據庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一個全面系統分析多種腫瘤免疫浸潤的數據庫之一[12]。首先在基因模塊我們分析了HLA-DPB1在人類部分腫瘤與相對應的腫瘤旁正常組織之間表達的差異性。然后分析HLA-DPB1表達水平與腫瘤浸潤細胞免疫基因標志物B淋巴細胞、T淋巴細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、T輔助細胞1(Th1))細胞、T輔助細胞2(Th2)細胞、T濾泡輔助細胞(Tfh)細胞、T輔助細胞17(Th17))的相關性。

3.UALCAN分析：UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)是對TCGA基因表達數據進行深層次分析的開放數據庫[13]。本研究通過在該數據庫分析HLA-DPB1在LUAD和正常樣本的表達,與LUAD臨床病理學特征(包括腫瘤分期、淋巴結轉移等)之間的相關性及潛在的預后價值。

4.GEPIA 數據庫 ：在 GEPIA 數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中[14]，我們分析了HLA-DPB1在LUAD和正常肺組織中的表達譜，并探究其表達水平與肺腺癌病人臨床分期和預后之間的關系。在相關性分析模塊中驗證了Timer數據庫中相關性較強的LUAD浸潤細胞免疫標志物基因與HLA-DPB1表達水平之間的相關性。

5.Lung cancer explorer、PrognoScan和Kaplan-Meier plotter數據庫：本研究通過PrognoScan(http://www.abren.net/PrognoScan/)、Lung cancer explorer(http://lce.biohpc.swmed.edu/)和Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)在線數據庫分析HLA-DPB1的表達水平與LUAD病人預后之間的相關性[15-17]。

結果

1.HLA-DPB1在LUAD組織中的表達降低，并且與LUAD病人臨床病理學特征和Tp53突變相關:數據庫分析顯示，HLA-DPB1在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、白血病、腎癌、卵巢癌、神經系統腫瘤等癌癥中表達上升，而在一部分腫瘤中表達下降，如肺癌、前列腺癌、結直腸癌、膀胱癌、黑色素瘤和骨髓瘤中表達降低(圖1A)。

A.Oncomine數據庫中HLA-DPB1在腫瘤中的表達；B.Timer數據庫中HLA-DPB1在腫瘤中的表達。aP<0.05;bP<0.01;c,P<0.001。

此外，通過Timer數據庫進一步分析HLA-DPB1在各種腫瘤中的表達，我們得出與Oncomine數據庫相同的結論(圖1B)。

在GEPIA數據庫中，我們同樣發現HLA-DPB1在LUAD組織中的表達下降，且差異有統計學意義。同時，我們還發現HLA-DPB1的表達水平還與LUAD病人的臨床分期有關(圖2A～B)。我們在 UALCAN 數據庫中也發現HLA-DPB1在LUAD組織中低表達，且差異有統計學意義(圖2C)。接下來，我們在多數據中心來源的Lung cancer explorer數據庫中對HLA-DPB1表達水平進行Meta分析發現HLA-DPB1在LUAD中處于低表達的狀態，預示著低表達HLA-DPB1的病人預后不良(P=2.1E-8)。

A.HLA-DPB1在肺腺癌病人組織中表達下降；B.HLA-DPB1表達下降與肺腺癌病人臨床分期相關；C.HLA-DPB1在肺腺癌病人組織中表達下降。

另外，我們還發現了HLA-DPB1表達水平與LUAD病人臨床病理學特征和Tp53突變相關(表1)。由此可表明HLA-DPB1表達水平與LUAD病人的發生發展相關。

表1 HLA-DPB1表達水平與肺腺癌臨床病理學特征相關

2.HLA-DPB1在LUAD病人中的預后價值：通過使用PrognoScan數據庫評估HLA-DPB1表達水平對LUAD病人生存率的影響，我們發現HLA-DPB1表達與LUAD病人的預后具有顯著相關性(圖3)。HARVARD-LC數據集顯示HLA-DPB1高表達與LUAD病人具有較好的總生存期( HR=0.64，95%CI=0.42～0.97，COXP=0.036822)(圖3A)。此外，MICHIGAN-LC、GSE13213、GSE13213數據集均顯示升高HLA-DPB1表達的LUAD病人傾向于具有更好的總生存期( HR=0.56，95%CI=0.32～0.99，COXP=0.047121；HR=0.47，95%CI=0.33～0.69，COXP=0.000087；HR=0.67，95%CI=0.49～0.91，COXP=0.010309)(圖3B～D)。

圖3 PrognoScan數據庫顯示更高的HLA-DPB1表達水平意味著更好的預后

另外，我們在GEPIA、Kaplan-Meier Plotter和Lung cancer explorer數據庫中進一步分析發現高表達HLA-DPB1的LUAD病人比低表達HLA-DPB1的病人預后更好(GEPIA:P=0.0022;Kaplan-Meier Plotter:P=2.7E-11;Lung cancer explorer:P<0.01)。這些結果表明，HLA-DPB1的表達降低可能是LUAD病人預后不良的危險因素。

3.HLA-DPB1表達水平與LUAD免疫浸潤細胞水平相關：結果發現HLA-DPB1表達水平與LUAD免腫瘤純度(tumor purity)、B 淋巴細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、嗜中性粒細胞和樹突細胞具有顯著相關性(P<0.05)。見圖4。

圖4 HLA-DPB1表達水平與肺腺癌腫瘤浸潤細胞相關

在Timer數據庫的Correlation模塊中，我們發現HLA-DPB1表達水平與LUAD免疫浸潤細胞(CD8+T 細胞、T 細胞、B 細胞、M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突細胞等)上的免疫標志物顯著相關(表2)。細致的講，在LUAD中，HLA-DPB1表達水平與CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3等免疫標志物顯著相關。

表2 HLA-DPB1表達水平與LUAD腫瘤浸潤細胞免疫標志物相關性分析

進一步通過GEPIA數據庫驗證HLA-DPB1表達水平與LUAD免疫浸潤細胞之間的相關性(表2)。我們發現，HLA-DPB1表達水平與LUAD浸潤 CD8+ T細胞、T細胞、單核細胞等顯著相關。具體而言，HLA-DPB1表達水平與LUAD免疫標志物CD8A、CD8B、CD19、CD79A、CCL2、IRF5、PTGS2、CD163、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3等細胞免疫標志物顯著相關。GEPIA分析結果與Timer數據庫結果相一致(表3)，均表明HLA-DPB1在LUAD免疫浸潤細胞中具有重要的調節作用，可能是參加腫瘤免疫逃逸過程中的重要部分。

表3 GEPIA數據庫中分析HLA-DPB1表達水平與LUAD免疫浸潤標志物水平之間的相關性

討論

腫瘤免疫治療的核心是喚醒體內免疫細胞，通過克服腫瘤免疫逃逸的機制來清除過度增殖的癌細胞[18]，包括免疫系統調節器、采用細胞療法、腫瘤抗原疫苗和免疫檢查點抑制劑[19-20]。目前，腫瘤微環境中的非細胞成分，如各種激素、可溶性蛋白、趨化因子、分子和細胞外基質等，已成為癌癥發展的研究重點和熱點[21]。因此，探索并發現新型生物標志物來預測LUAD病人預后，并提供新的治療靶點來改善病人預后顯得至關重要。

HLA-DPB1是位于人類第6號染色體上的主要組織相容性復合體Ⅱ級(major histocompatibility complex,class Ⅱ,MCH Ⅱ) 相關DPB1區域的免疫浸潤細胞之一，該區域具有高度多態性[22]。HLA-DPB1抗原常表達于免疫T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等表面，主要通過識別并結合相關肽分子向活化的CD4+ T細胞提供免疫信息，促進其增殖和細胞毒性，從而在免疫系統中發揮重要作用。有研究報告證明，HLA-DPB1可以促進免疫力，對血液系統的免疫治療至關重要[23-24]。與正常乳房樣本相比，HLA-DPB1的mRNA表達在乳腺癌組織中也有所增加，尤其是在雌激素受體陰性、基底樣變和三陰性乳腺癌狀態下的乳腺癌組織中。生存分析顯示，升高HLA-DPB1表達水平預示著病人有較好的總生存期、無復發生存期和遠處無轉移生存期[9]。HLA-DPA1 表達水平下降與小兒腎上腺皮質腫瘤(adult adrenocortical tumors，ACT)患兒的不良預后顯著相關。HLA-DPB1低表達水平與ACT病人短5年無終末生存期相關。此外，HLA-DPB1是影響ACT病人預后的獨立因素[10]。

本研究利用多個在線數據庫分析HLA-DPB1在LUAD中潛在的臨床價值。我們發現，HLA-DPB1在LUAD病人腫瘤組織中的表達下降， 并且HLA-DPB1的低表達與LUAD病人的臨床病理特征(性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期、組織學亞型、淋巴結轉移情況以及Tp53突變情況)和生存時間相關，HLA-DPB1表達降低的病人預后較差，差異具有統計學意義。Meta分析進一步證實其結果的可靠性，表明HLA-DPB1有望成為LUAD病人治療的新靶點和預測預后的新標志。

本研究在Timer和GEPIA數據庫中證實，HLA-DPB1表達水平與免疫細胞標志物CD8A、CD8B、CD19、CD79A、CCL2、IRF5、PTGS2、CD163、CEACAM8、NRP1、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、IL13、IL21、STAT5B、TGFB1、PDCD1、CTLA4和LAG3 等表達水平相關。HLA-DPB1與LUAD免疫浸潤關系密不可分。本研究缺乏臨床LUAD組織標本中HLA-DPB1的表達情況，是研究的不足。本研究結果表明，HLA-DPB1在LUAD組織中的表達下降，升高 HLA-DPB1表達水平有望改善LUAD病人的預后。HLA-DPB1表達水平與LUAD免疫浸潤細胞和免疫標志物分子水平顯著相關，預示著其在LUAD進展過程中具有重要的生物學作用，且為LUAD病人的治療提供了一個新的思路。