一株淡水小球藻的分離純化及鑒定

胡佳文，聶志娟，孫 毅，邵乃麟，李全杰，徐鋼春

(中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫 214081)

綠藻廣泛分布于淡水中，在海水中也有少量分布，種類繁多，包含小球藻、衣藻和團藻等。大多數綠藻都含有葉綠體，可進行光合自養，將二氧化碳、氮、磷等無機營養物質通過光合作用轉變為高價值次生代謝物，如衣藻富含淀粉和油脂、小球藻含有豐富的蛋白質、糖類、氨基酸和多種維生素。因此綠藻可作食品、飼料、化妝品以及藥業的重要原材料。綠藻物種豐富、分布廣泛，在淡水中的藻類品種亦是繁多，為合理地對單一藻種進行深入研究和產業應用，需對淡水中的有益優勢藻種進行分離純化。本文從鱸魚養殖水體中分離得到了一株土著綠藻優勢種。通過光學顯微鏡觀察，該土著藻種的形態特征與小球藻相似，經ITS基因序列分子鑒定為小球藻。

一、材料與方法

1.分離純化

在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心揚中基地加州鱸養殖池塘中，采集經200目篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣置于三角錐形瓶中，加入無菌BG11培養液進行富集光照培養，1周后，顯微鏡下采用微吸管分離選取優勢綠藻，并均勻涂布于LB 固體培養基。挑選生長較好的單一綠色藻落進行下一步的分離純化至顯微鏡下無其他雜藻可見。培養溫度(25±1)℃，光照周期夜∶晝＝12∶12，光照強度3000～5000勒克斯。

2.形態觀察

該綠藻優勢種經過分離純化后，在LB 固體培養基上光照培養，觀察藻落形態，在光學顯微鏡10 倍×40 倍下觀察并拍照，依據形態學特征進行初步鑒定。

3.分子鑒定

(1)DNA 提取與擴增。采用6540-400 FastDNA Kit(Mpbio)試劑盒提取藻DNA。對ITS 基因序列進行PCR擴增。

引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’。

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR 反應體系(25 微升)：DNA 模板1.0 微升、引物各1.0 微升(引物濃度10 微摩/升)、Taq Master MIX 12.5 微升、dH2O 9.5 微升，定容至25微升。

PCR 反應程序：95℃5 秒，50℃10 秒，60℃150 秒，35 個循環，最后10℃保存。PCR 結束后從PCR儀上取下，待下一步處理。

(2)測序測定和分析。PCR 產物純化回收后進行測序，將測序結果與NCBI 數據庫中的序列進行BLAST在線比對分析，觀察比對結果，找到與原序列相似度最高的序列，并下載相關序列。通過Mega-X 軟件采用鄰接法構建進化樹，并建立遺傳距離表，通過進化樹的聚類結果進行物種鑒定與遺傳關系分析。

二、結果

1.形態特征

光學顯微鏡觀察及培養皿培養結果見圖1。藻株直徑在5～10微米。該藻株為單細胞藻，呈圓形或近圓形，表面光滑無凸起，無鞭毛。胞體鮮綠色。藻株在光學顯微鏡下的顏色、大小、形狀都符合小球藻的特征，可初步判定分離的綠藻為小球藻。

圖1 光學顯微鏡下藻株形態(左)及培養皿培養(右)

2.分子鑒定

實驗中擴增到該土著綠藻優勢種的ITS基因序列，大小約751 bp，序列在NCBI 中進行blast 同源性分析，結果顯示該序列與GenBank 中36 條序列具有很高的同源性(96%～100%)。比對結果顯示，與Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)的序列相似性最高，為100%，其次是Chlorella vulgaris isolate liming lake 1(MN103781.1)。獲取同源序列后，使用megaX 內置的clustal W 進行多序列比對，使用NJ 模型構建進化樹，設定bootstrap 為1000，選擇Marvania coccoides CCAP 251/1A(FR865696.1)作為外類群。進化樹結果顯示，與Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)聚為一支，同源性最高，自展值為100%，統計置信度處于非常顯著的水平且遺傳距離最小，為0.0040。進化樹結果與比對結果一致得出，分離純化的優勢綠藻種為chlorella sorokiniana isolate SM12_1，屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬。

三、討論

本文通過微吸管分離和平板純化分離出一株綠藻優勢種，并通過形態學以及分子生物學鑒定明確了該藻株為小球藻。

本實驗用顯微鏡觀察藻株形態發現細胞壁、胞體直徑、顏色等形態特征與小球藻相符。形態特征雖然是分類學的重要依據之一，但不一定精確。在水生生態系統中，許多浮游藻類存在表型可塑性，即一種基因型在不同的環境條件下呈現多種表型的現象(楊州，2008)。浮游藻類可能產生不同的表型以應對外界環境條件的變化，改變自身形態形成群體或集聚是最常見的一種形式(Huang，2018)。溫度、pH、鹽度等非生物因素可能誘導藻類發生形態變化，細菌、沉水性植物也可改變藻類表型。有研究發現金魚藻對小球藻有顯著的形態和生長效應(常孟陽，2019)。普通小球藻對菹草有形態響應，可促進小球藻群體的形成(常孟陽，2019)。因此，僅僅依據形態學來鑒定物種結果可能會出現差錯。分子鑒定相比較形態學鑒定結果更精確。微藻體積微小，但對整個微藻進行DNA測序工作量大且成本高昂，因此通常選取特異性基因片段進行PCR擴增，將擴增產物克隆測序后與基因數據庫中序列進行同源性比對，最終確定微藻的分類學地位。核基因組編碼的ITS序列變異位點數量豐富(曲凌云，2008)，是一個理想的微藻鑒定基因。由于小球藻形態特征明顯，綜合考慮鑒別效率和精確性，可先通過形態學大致判定種類，再結合分子鑒定進一步確認。

小球藻培養過程中積累了大量蛋白質、脂質、多糖和類胡蘿卜素等高價值代謝產物，是天然綠色的魚苗開口餌料，也是蝦類、貝類的優質餌料，還是用來培育供魚苗攝食的動物性餌料如輪蟲、枝角類等的優質基礎餌料。此外，小球藻可以用來進行生物廢水修復以及水質治理，治理效率高、成本低并且生態環保。因此，小球藻規?；ㄏ蚍€定培養具有很大發展前景。本文分離純化一株綠藻并鑒定為小球藻，助力綠色養殖模式建立，豐富小球藻種質資源，有助于推動小球藻規模化定向生產。