基于D-loop序列分析的綠海龜人工繁育群體的遺傳多樣性

謝子強，肖寶華，廖寶林，姜怡薇，陳華靈，葉明彬

(1.廣東海洋大學 深圳研究院，廣東 深圳 518000；2.深圳市碧海藍天海洋科技有限公司，廣東 深圳 518000；3.廣東惠東海龜國家級自然保護區管理局，廣東 惠州 516359)

0 引言

在過去的20年里，生物多樣性的保護已經成為一個緊迫的全球性問題。森林砍伐、過度開發、農業擴張和物種入侵是導致物種及種群嚴重減少的一些因素，并對食物網的功能和生態系統的可持續性產生負面影響[1-4]。包括綠海龜(Cheloniamydas)在內的眾多珍稀水生野生動物正在面臨嚴重的種群衰退[5-6]。綠海龜隸屬于海龜科(Cheloniidae)海龜屬(Chelonia)，是我國分布的5種海龜中種群數量最多的物種，現為我國一級保護動物[7-8]。為了應對日益減少的綠海龜種群狀況，通過科學的人工繁育技術手段進行擴繁、野化、放歸和種群復壯，成為綠海龜種群資源恢復的一條行之有效的途徑[9]。早在20世紀70年代，美國(佛羅里達)、日本、開曼(英屬)等國家和地區，先后實現綠海龜的人工繁育，并應用于野生種群修復和商業開發，其中開曼海龜農場(CTF)已是全球最大、技術也最為成熟的綠海龜人工繁殖場[10]1638。而在國內，廣東惠東海龜國家級自然保護區開展了大量綠海龜人工繁育的技術研究[11-12]，并在國內首次全人工繁育出綠海龜子代[13]。雖然國內外已有不少綠海龜人工繁育實踐的案例，但由于綠海龜繁育周期長，經過多代繁育后綠海龜群體的遺傳多樣性是否會降低進而影響繁育后代品質，成為目前海龜人工繁育中亟待解決的問題。

D-loop序列是線粒體DNA中的一段非編碼區序列，具有母系遺傳，突變率高，進化速率快且缺乏基因重組等特點[14]。相比COI、16s rRNA、cyt-b等傳統分子標記能累積更多遺傳變異，是研究種內群體遺傳多樣性及遺傳分化的理想標記[15]。目前，國內外已有許多學者通過D-loop序列標記對全球綠海龜群體遺傳多樣性情況開展研究。Barbanti等[10]1637通過D-loop序列標記對開曼群島筑巢的野生雌性綠海龜和開曼群島海龜農場人工繁育(CTF)的雌性綠海龜的樣本進行遺傳多樣性分析，發現人工繁育種群和野生種群的多樣性沒有顯著差異，與野生種群相比，人工繁育單倍型變異水平甚至更高。Nurhartini等[16]20通過D-loop和16s rRNA序列研究了馬來西亞海域的野生綠海龜群體的遺傳多樣性情況。楊文嘉[6]5通過包括D-loop在內的多種分子標記對中國南海海域的175只綠海龜進行了遺傳多樣性研究，初步探究了我國南海綠海龜種群遺傳結構。但目前，有關國內人工繁育綠海龜子代遺傳多樣性現狀仍未見報道。

本研究通過D-loop序列部分片段作為分子標記，對廣東惠東海龜國家級自然保護區人工繁育的子代綠海龜群體的遺傳多樣性進行研究，為建立相應的綠海龜人工繁育遺傳譜系以及開展綠海龜種質資源保護奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1 樣品采集

本研究的人工繁育綠海龜組織樣品采自廣東惠東海龜國家級自然保護區，綠海龜樣本均為保護區近年來人工繁育的群體，其中包括2020年人工繁育1號群體26個樣本(編號G，為同一母龜子代)、2020年人工繁育2號群體26個樣本(編號H，為同一母龜子代)、2019年人工繁育群體26個樣本(編號LM，來自多個母龜子代)、2017年人工繁育群體21個樣本(編號C，為同一母龜子代)，共計99個樣本。采集樣品的綠海龜均為活體，剪取綠海龜前鰭少量上皮組織并保存在無水乙醇中，剪取完畢后用安多福溶液對剪取的傷口進行消毒。采集的樣品除了記錄編號以外，同時記錄相應取樣海龜的電子芯片號碼等其他相關信息。

1.2 基因組總DNA的提取

使用北京擎科生物科技有限公司生產的動物基因組DNA提取試劑盒(TSP201-200)提取海龜上皮組織樣品的DNA，所提取的DNA置于-20 ℃保存備用。

1.3 引物設計合成

D-loop基因的PCR引物參考Nurhartini 等[16]21的研究論文。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，上下游引物序列分別為TCR-5：TTGTACATCTACTTATTTACCAC(5′-3′)和TCR-6：GTAAGTAAAACTACCGTATGCCAGGTTA(5′-3′)。

1.4 PCR擴增和DNA測序

PCR反應體系反應總體積50 μL：1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物) 47 μL，上下游引物各1 μL,DNA模板1 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30個循環，最后72 ℃延伸5 min。將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+ 6 μL溴酚藍)，300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定擴增條件是否單一，是否彌散，有無非特異性條帶。選取擴增質量較高的PCR產物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，獲得測序峰圖和堿基序列。

1.5 序列分析

2 結果與分析

2.1 序列多態性分析

本研究擴增獲得了99條D-loop基因序列，排序去除兩端冗余序列后得到堿基片段在390～395 bp之間。在這99條D-loop基因序列中T、C、A和G堿基的平均含量分別為35.3%、14.7%、32.8%和17.2%，其中A+T含量(68.1%)明顯高于C+G含量(31.9%)，堿基組成具有明顯的偏向性(表1)。

表1 人工繁育4個群體D-loop基因片段的堿基含量比例

2.2 群體遺傳多樣性及單倍型分析

在99條D-loop基因序列中，共檢測出18個變異位點數，每個群體的單倍型多樣性指數(Hd)在0.000～0.212之間，99個樣本的單倍型多樣性指數為0.634；每個群體的核苷酸多樣性指數(π)在0.000 00～0.001 11之間，99個樣本的核苷酸多樣性指數為0.018 58(表2)。根據Grant和Bowen[17]的研究報道，種群單倍型多樣性指數以0.5為臨界值，核苷酸多樣性指數以0.001為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本研究每個群體內的種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性均未超過臨界值，表明其每個種群內的遺傳多樣性差異較小。但以99個樣本為一個總群體來算，其種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性均超過臨界值，總群體的遺傳多樣性差異較大。

表2 綠海龜人工繁育4個群體D-loop基因的遺傳多樣性指數

在99條D-loop基因序列中共檢測出3個單倍型，其中共享單倍型有2個(Hap_1和Hap_3)。從單倍型網絡中介圖(圖1)可以看出，各單倍型之間的突變步數為1～16步不等，Hap_2僅含有G組群體的所有樣本，Hap_1含有C組和部分LM組群體的樣本，Hap_3含有H組和部分LM組群體的樣本。通過在NCBI上進行的序列比對，并查閱有關太平洋地區海龜單倍型分類的國際命名編號[18-19]，確認Hap_1對應的單倍型為CMP 18，Hap_2對應的單倍型為CMP 95，Hap_3對應的單倍型為CMP 49。

圖1 基于D-loop基因序列的綠海龜人工繁育4個群體單倍型網絡中介圖

2.3 遺傳分化和基因流

從群體間的遺傳分化結果(表3)可以看出，G組和H組間的群體遺傳分化系數(Fst)值最大(1.000 0)；其次為G組和LM組間、C組和LM組之間的Fst值，均大于0.25；H組和LM組之間的Fst值最小，在0.05與0.15之間。Fst是一個衡量群體間遺傳分化程度的參數：Fst<0.05表示分化較小，0.05

表3 基于D-loop基因的群體間Fst(對角線左下方)和Nm值(對角線右上方)

表4 人工繁育4個群體D-loop序列的種群AMOVA分析

2.4 基于D-loop序列片段對綠海龜人工繁育群體的系統進化分析

以棱皮龜(Dermochelyscoriacea)作為外源種(GenBank序列號：AF121964.1)，加入Nurhartini等[16]21研究報道中的3個馬來西亞綠海龜樣本的D-loop片段序列(GenBank序列號：HQ377528.1、HQ377535.1、HQ377538.1)，采用鄰位連接法構建綠海龜人工繁育4個群體的D-loop系統發育樹(圖2)。結果顯示G組群體獨立成為一支，并與馬來西亞的2個樣本聚成第一個大分支；C組群體的樣本與LM12、LM13和LM24聚為一支，剩余的LM組群體樣本與H組以及馬來西亞的1個樣本聚為一支，再合并為第二個大分支。

圖2 利用D-loop序列數據構建的分子系統進化NJ樹

3 討論

在野生環境中，絕大部分海龜都有產卵洄游的特性，成年雌性海龜會在正常情況下準確地找回其出生地進行繁殖產卵活動，每次產卵前可與多只公龜進行交配以豐富后代的遺傳多樣性[21-22]。綠海龜從出生一般要經歷20～50年才達到性成熟，繁育周期長[23]。綠海龜的這些繁殖特性給其人工繁育帶來了一定難度。本研究材料為廣東惠東海龜國家級自然保護區近年來人工繁育群體，其父本、母本均為海龜保護區經野外采卵、人工孵化及圈養至性成熟的海龜。與其他經濟性水生野生動物不同，綠海龜超長的性成熟繁育周期使其無法快速開展全人工選育工作，無法采集到更多世代的繁育樣本進行深入的遺傳結構分析。本研究的人工繁育4個群體中，G、H和C組群體均各自來源于同一個母本繁殖的后代，其D-loop基因來自母系，單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數均為0，其群體內不存在遺傳差異；LM群體為多個母本后代的混合體，根據記錄顯示該種群母本數有2個以上，這也與該群體的單倍型有2個，群體內存在一定遺傳差異的分子數據結果相吻合。因此僅以母系遺傳的線粒體分子標記無法直接評估同個母本所繁育子代的遺傳多樣性，需要結合微衛星等非母系遺傳的分子標記來進行評估。

早在20世紀90年代，Bowen等[21]871學者通過對全球綠海龜線粒體基因型研究最早提出全球綠海龜種群形成了2個主要的地理群體，一個為大西洋-地中海地理群體，另一個為印度-太平洋地理群體。經過近30年的研究，尤其是通過更多的現代分子遺傳學技術手段的佐證，該理論得到了完善和補充，并進一步明確了大西洋、地中海、印度洋、西太平洋、中太平洋和東太平洋等相對較小區域的綠海龜種群遺傳結構[24-27]。Jensen等[28]通過收集全球127個棲息地的4 878個綠海龜樣本的mtDNA數據集，對種群的聯通性和基因流動障礙進行了深入的研究，并通過D-loop序列歸納了11個綠海龜線粒體DNA譜系。本研究的人工繁育群體的3種單倍型，分別與Jensen研究報道中的日本譜系(CMP 95)和印度洋-太平洋譜系(CMP 18和CMP 49)的單倍型相一致，符合廣東惠東海龜國家級自然保護區親本海龜來源情況。中國華南沿岸地區是日本譜系、印度洋-太平洋譜系和西太平洋中部譜系3個地理譜系綠海龜洄游的交界區域，從遺傳育種的角度看，在該地區開展綠海龜的遺傳雜交育種有利于提升本地區海龜品種的遺傳多樣性水平。

不同群體間的遺傳分化系數值和基因流值反映了其分化狀況的程度,本研究的群體間具有較高的遺傳分化現象，G、H和C組群體間的值均為1，這表明這3組群體間存在完全分化的遺傳現象，這也從側面說明用于選育的母本具有豐富的遺傳多樣性。同時，選擇Nurhartini等[16]24研究報道中的3個遺傳分化度最高的馬來西亞野生綠海龜樣本與本研究的樣本進行系統進化關系分析，發現G組樣本與馬來西亞2個樣本聚成一個大分支，而H組與大部分LM組和另一個馬來西亞樣本聚為一個小分支，說明本研究的人工繁育種群與東南亞海域野生種群之間沒有明顯的遺傳分化。Barbanti等[10]1644研究報道指出開曼群島筑巢的野生種群和開曼群島海龜農場(CTF)人工繁育種群的多樣性沒有顯著差異，人工繁育種群單倍型變異水平甚至更高，其開展人工繁育的時間已經長達50年。因此本研究結果表明，借鑒國外綠海龜人工繁育的經驗，通過分子標記技術對開展選育的綠海龜親本遺傳譜系的構建，開展科學合理的選育，可保持繁育子代遺傳多樣性結構的穩定，后代群體在未來幾十年中仍將具有豐富的遺傳進化潛力。