葡萄葉面肥富硒特性及可溶態硒分布研究

闕小峰，余 雁，方志成，司文會，胡雪平

（1.蘇州農業職業技術學院食品科技學院，江蘇 蘇州 215008；2.蘇州事達泰信標準技術有限公司，江蘇 吳中 215100；3.蘇州昆山巴城葡萄種植園，江蘇 昆山 215311）

硒是人體必需的微量元素，具有清除體內自由基、解毒和排毒、抗氧化、清除膽固醇、增強人體免疫力、抗癌和防癌的作用，被譽為“抗癌之王”［1］。調查顯示，中國約有72%的國土面積不同程度缺硒，成人日平均硒攝入量為26～32 μg，低于中國營養協會推薦的攝入量 50～250 μg［2］。研究證明，植物性產品中有機硒的生物利用率大于無機硒鹽［3］，利用植物對硒的生物轉化及富集作用，提高植物可食部分硒的含量，是補充人體硒含量最經濟有效和安全的方法。

本研究結合蘇南地區優質綠色葡萄產業發展趨勢，選用夏黑葡萄作為研究對象，通過施葉面硒肥的方式進行富硒葡萄栽培，采用HG-AFS 法測定葡萄中硒含量，研究不同濃度的硒肥對葡萄果實中硒含量的影響和施硒肥時期對夏黑葡萄果實硒含量的影響，找到最佳的施硒梯度和時間，探討以葉面噴施氨基酸硒肥生產富硒葡萄的應用效果，為推廣應用葡萄富硒生產技術及產品綜合開發利用提供理論依據；再采用HPLC-ESI-MS 法對富硒葡萄的有機硒含量進行分析測定，比較不同形態硒的相對含量，了解其不同可溶態硒的分布規律，為富硒栽培技術提供理論基礎，以實現缺硒區域人群安全有效補硒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5 年生夏黑葡萄植株，每公頃產量在2.7 萬kg 以上。試驗材料由蘇州昆山巴城萬畝葡萄生產基地提供。

1.2 富硒試劑

富硒試劑由江蘇省食品安全快速檢測工程技術研究開發中心、蘇州農業職業技術學院食品科技學院葡萄富硒項目課題組聯合研制，濃度為20 g/kg（以Se（Ⅳ）計），富硒劑中含有高濃度硒元素（亞硒酸鈉、氨基酸螯合硒等含硒化合物，以硒元素0.1%～30.0%（質量/體積，M/V）計）、氨基酸營養素（谷氨酸等，0.1%～5.0%（M/V）計）、促吸收劑（環糊精、碳酰二胺等，0.001%～1.000%（M/V））和輔助營養物質（磷酸鹽、硫酸鹽、葡萄糖等物質，0.01%～20.00%（M/V）），試驗時稀釋使用。以上試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 硒肥不同濃度試驗 試驗葡萄每333.5 m2分為一區，將濃縮氨基酸硒液對去離子水稀釋，根據植物的硒安全限值，以0、50、100、150、200、250、300、400、500 mg/kg 的硒肥，從夏黑葡萄第一次果實膨大期（幼果發育期）開始，每隔15 d 噴施1 次，直至果實采收前15 d 停止，共噴施6 次。第二年不施肥，依靠土壤中殘余硒吸收積累。

1.3.2 葡萄不同時期葉面噴施硒肥試驗 試驗葡萄每333.5 m2分為一區，將濃縮氨基酸硒液按“1.3.1”試驗確定的最佳富硒濃度，經對去離子水稀釋后，依次從葡萄植株的綻葉期、初花期、盛花期及幼果發育期開始葉面噴施富硒試劑，每隔15～20 d 噴施1 次，直至果實采收前15 d 停止，共噴施8～10 次，噴施氨基酸硒葉面肥總量不變，隨著葡萄生長周期變化，適當縮短噴施時間間隔。試驗期間葡萄的施肥、除蟲除草、修剪、施肥追肥等管理按正常情況進行。

1.4 樣品處理及硒含量和可溶態含量檢測

1）樣品處理。收獲成熟的葡萄去梗去蒂，先用大量自來水洗凈表皮，再用去離子水洗滌3～4 次，平鋪在實驗臺上，自然風干果實表面的水分后，放入-85 ℃的冰箱中凍干24 h，然后將葡萄樣品置于真空冷凍干燥系統（真空度3.5 Pa，溫度-55 ℃）中放置48 h，取出后再放入冷凍干燥器中干燥，獲得富硒葡萄樣品。第二年收獲葡萄處理過程同上。

2）硒含量測定。依據GB 5009.93—2010《食品安全國家標準食品中硒的測定》，采用氫化物-原子熒光光譜法（HG-AFS 法）［4，5］對試驗葡萄中的硒含量進行測定。

3）硒可溶態測定。采用分離檢測聯用技術［7］高效液相色譜-電噴霧串聯質譜聯用技術（HPLCESI-MS）法來檢測各可溶態硒含量［6-8］。檢測過程在蘇州事達泰信標準技術有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 硒肥不同濃度對夏黑葡萄果實硒含量的影響

硒肥不同濃度對夏黑葡萄果實硒含量的影響見圖1。由圖1 可知，2019 年葉面噴施氨基酸硒肥的葡萄硒含量要遠高于2020 年種植的葡萄；硒肥濃度對葡萄中的硒含量有很大影響。硒肥濃度在0～250 mg/kg 時，夏黑葡萄中的硒含量隨施硒濃度遞增不斷增加；當硒肥濃度為250 mg/kg 時，葡萄中硒含量達 119.7 μg/kg；當硒肥濃度超過 250 mg/kg 時，葡萄中的硒含量則隨濃度增加而減少。表明低濃度葉面硒肥利于葡萄果實中硒的富集，濃度過高時則會對葡萄吸收硒的能力產生抑制作用［9］。2020 年種植的夏黑葡萄中硒含量大大減少，富硒含量最高為19.2 μg/kg，明顯不符合生產富硒葡萄的要求［10］。這表明土地中的硒一部分向葡萄中轉移，另外一部分發生水土流失，土壤作為硒源的能力變差，且根部富硒明顯不利于葡萄富硒，需在下一年再重新施加葉面硒肥才能達到生產富硒葡萄的目的。由此可確定葉面氨基酸硒肥濃度250 mg/kg 為最佳硒肥濃度，可以促使葡萄吸收大量的硒，又不影響其生長發育，可為大面積種植富硒葡萄提供參考。

圖1 硒肥不同濃度對夏黑葡萄果實硒含量的影響

2.2 噴施硒肥時期對夏黑葡萄果實硒含量的影響

從夏黑葡萄生長發育的綻葉期、初花期、盛花期及初果期等不同時期開始葉面噴施氨基酸硒肥，葡萄成熟前15 d 采集樣品，檢測夏黑葡萄果實含硒量、土壤樣品（含富硒地塊土壤、未富硒地塊土壤），測定結果見表1。由表1 可以看出，分別從葡萄綻葉期、初花期、盛花期、初果期開始噴施硒肥，葡萄果實內富集的硒含量分別為138、108、46、28 μg/kg，分別是對照組硒含量的 27.6、20.4、8.8 和 6.0 倍。從圖 2 可見，葡萄果實中的硒含量隨著施硒時期的推遲呈下降趨勢，兩者顯著相關（R2=0.959 4），從綻葉期開始富集硒，最終葡萄果實硒含量是盛花期、初果期的3.0 和 4.9 倍，總硒量最高達 138 μg/kg，夏黑葡萄富硒試驗效果明顯。

圖2 夏黑葡萄不同富硒時期與果實硒含量的相關性

表1 不同生長時期開始噴施硒肥后夏黑葡萄及土壤的硒含量 （單位：μg/kg）

研究表明，添加外源硒肥，葡萄果實能吸收存儲更多的硒。葉面噴施氨基酸硒肥顯著增寬了葡萄葉片面積，改善了葉片質量；增加了葉片硒素營養，提高了植物體葉片的總糖、還原糖、葉綠素、可溶蛋白質的含量，降低了粗纖維和亞硝酸鹽的含量；提高了葉片凈光合速率，有助于增強植物葉片的光合作用，促進植物生長，提高產量和增加抗逆性［11，12］。因此，從葡萄生長發育初期開始葉面噴施氨基酸硒肥，有助于硒更早地貯存在植物葉片內，進而通過葉片的生物作用將硒轉運至葡萄果實內，是實現生產富硒葡萄的有效途徑，相比于根部吸收富硒要更有效。同時，通過對富硒組和對照組土壤中硒含量的檢測發現，其硒的含量基本相同，分別為79、78 μg/kg，可見土壤中硒含量雖高，但葡萄生長發育過程中從土壤中吸收轉化硒的幾率很小，對葡萄果實中的硒含量增加沒有明顯效果。因而，選擇夏黑葡萄生長發育的初期（綻葉期）開始通過葉面噴施硒肥的方法富硒，葡萄成熟時果實內所含硒量較高，能有效增加葡萄硒含量。

2.3 富硒夏黑葡萄果實中可溶態硒的分布

在不同施硒濃度的富硒葡萄中總硒量測定基礎上，選擇最佳富硒濃度（250 mg/kg）的葡萄樣品，采用不同浸提劑（0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、pH 7.2 Tris-HCl、去離子水）提取富硒葡萄中不同可溶態硒［13］（堿溶態、酸溶態、Tris-HCl 態、水溶態），選擇不同浸提溫度（20～60 ℃）和浸提時間（20～100 min）提取富硒葡萄中的堿溶態硒、水溶態硒、酸溶態硒和Tris-HCl 態硒，分析各浸提液中不同形態硒含量的變化規律，從而在最佳提取條件下對葡萄中的不同可溶態硒進行定量分析。

由圖3a 可知，不同浸提溫度對富硒葡萄硒可溶態分布影響差異明顯。堿溶態硒隨溫度升高表現出先上升后降低的趨勢，在40 ℃時硒提取量最高，而酸溶態硒、Tris-HCl 態硒和水溶態硒含量在不同浸提溫度條件下表現平緩，且硒提取量顯著低于堿溶態硒。原因可能是，經噴施葉面氨基酸硒肥，葡萄利用葉片生理作用吸收富集，與葡萄中主要營養成分多糖和蛋白轉化形成硒蛋白或硒多糖類有機硒，溫度在20～40 ℃，隨溫度升高時，蛋白態硒和多糖態溶解度增大，可溶態硒提取率升高；但溫度繼續升高時，蛋白、多糖類化合物結構破壞，分子表面親水基團的數量降低，引起可溶態蛋白質或多糖類大分子化合物聚集沉淀，造成浸提的可溶態硒含量降低［14，15］，當溫度升至 40～60 ℃時堿溶態硒的含量逐漸下降。由此可知，堿溶態對有機硒的吸收利用較為明顯，最佳浸提溫度為40 ℃。人體內血液pH 在7.0～7.2，弱堿性的血液環境有利于堿溶態硒的吸收利用，有助于人體補硒。

由圖3b 可知，不同浸提時間對富硒葡萄可溶態硒的變化影響不同，表現為堿溶態硒與酸溶態硒含量都隨著浸提時間的延長而增加，且堿溶態硒含量表現更為突出；而水溶態硒與Tris-HCl 態硒含量對浸提時間的變化不明顯。說明堿液能夠隨著時間的增加溶解更多的硒蛋白或硒多糖等有機態硒。酸液浸提時，部分無機態硒也隨著浸提時間延長逐漸被浸提，最終趨于穩定。結合測定分析，浸提時間越久，對堿溶態硒提取越有效，考慮到生產實際，水溶態硒與Tris-HCl 態硒的浸提時間為40 min，堿溶態硒與酸溶態硒的浸提時間以80 min 為宜。

圖3 不同條件（浸提溫度、提取時間）對富硒葡萄果實中可溶態硒的影響

3 小結

在夏黑葡萄植株生長的不同時期，通過葉面噴施氨基酸硒肥栽培富硒葡萄，考察其富硒特性及硒可溶態分布規律。結果表明，最佳富硒硒液濃度為250 mg/kg，葡萄富硒效果顯著；通過從夏黑葡萄不同生長時期（綻葉期、初花期、盛花期、初果期）開始噴施葉面硒肥，發現綻葉期就開始定期噴施葉面硒肥可顯著改善葡萄葉片質量，提高葉片凈光合速率，通過葉片的吸收轉化，有助于葡萄果實的有機態硒富集，夏黑葡萄硒含量最高達138 μg/kg。能滿足人體每日硒攝入量50～250 μg/kg 的需求［16］，實現富硒葡萄的生產，且富硒效果明顯。進一步通過測定不同浸提劑（NaOH、HCl、Tris-HCl、H2O）在浸提溫度、時間等因素下提取的各可溶態硒含量，分析總結出硒在葡萄中的變化分布規律，堿態硒在40 ℃、80 min下有最好的提取率，有利于人體補硒，同時也為富硒葡萄栽培、綜合開發利用提供了參考。