軟棗獼猴桃葉片愈傷組織誘導技術研究

朱君麗，李育川

（昆明學院農學與生命科學學院，昆明 650000）

軟棗獼猴桃［Actinidia arguta（Sieb. & Zucc）Planch.ex Miq.］，屬獼猴桃科（Actirlidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）多年生落葉藤本植物［1］，果皮光滑無毛，富含維生素C、鈣、磷、鉀、鐵等物質［2］，有調中理氣、解熱除煩、生津潤燥之效［3］，對消化不良、食欲不振、嘔吐［4］、燒燙傷、肝炎、高血壓和心腦血管疾病［5］有一定治療作用，且對瘦身減肥及護肝均有獨特的功效［6］，果肉含有抗氧化物質，可增強人體免疫力［7］，果汁對食道癌有一定療效［8］。中國野生軟棗獼猴桃資源較為豐富，分布廣泛，但經營模式粗放，近乎掠奪式地采摘，導致資源破壞嚴重［9］。隨著野生品種引種馴化工作的逐步進行，軟棗獼猴桃優良苗木的需求劇烈增加，而當前軟棗獼猴桃多采用傳統種子繁殖［9，10］、扦插繁殖［11，12］等方式，不僅生長周期長且變異大成活率低［13］，難以保持親本的優良性狀，限制了軟棗獼猴桃良種的開發與推廣［14-16］。為擴大軟棗獼猴桃的繁殖數量與馴化栽植規模，適應市場需求，利用生物技術對軟棗獼猴桃進行組織培養，研究軟棗獼猴桃葉片愈傷組織的誘導技術，縮短育苗時間，減少外植體浪費，提高苗木的成活率，為軟棗獼猴桃的工業化生產，規模化種植奠定基礎，為良種軟棗獼猴桃的組培工廠化發展提供技術支持及試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃展葉由昆明學院李育川教授提供。大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素、2，4-D、生長調節劑KT、瓊脂、蔗糖、75.0%和90.0%的CH3CH2OH、0.1%～1.0% HgCl2、2.0%～10.0% NaClO、漂白粉飽和溶液由昆明學院組培室提供。

1.2 方法

1.2.1 不同消毒處理對完全展開葉片的消毒方法在潘立斌等［13］、王春華［14］的研究基礎上，將采集的外植體葉片，用自來水加洗潔精沖洗表面，流動自來水沖洗1 h 后在無菌條件下，以75.0% CH3CH2OH 浸泡處理 30 s，去離子水沖洗 3～4 次，10.0% NaClO 分別滅菌5、15、20 min，期間不斷振蕩，去離子水沖洗3～4 次，再以 0.1% HgCl2分別處理 7、10、15 min。試驗方案見表1。

表1 不同的消毒處理對完全展開葉片消毒試驗設計

1.2.2 不同培養基配方對葉片愈傷組織誘導效果的研究方法 以MS、1/2MS、WPM 為基本母液培養基，分別添加不同濃度的 2，4-D、KT，pH 調至 5.8，試驗方案見表2。切除葉尖、葉緣和葉柄的多余部分，擴大軟棗獼猴桃葉片傷口，提高愈傷組織誘導率。切成約0.5 cm×0.5 cm 的葉塊，葉片背面朝下接至培養基。試驗共設9 個處理，3 次重復，每處理10 瓶，每瓶15 片。培養基在121 ℃高溫高壓滅菌2 h。培養環境條件為光照度2 000～2 500 lx，時間10 h/d，（26±2）℃，濕度70%～80%。

表2 不同培養基配方對軟棗獼猴桃葉片愈傷組織誘導試驗設計 （單位：mg/L）

1.2.3 測量指標及方法 生長狀況：顏色、質地、生活周期；大塊愈傷組織：＞1.4 cm；中塊愈傷組織：0.7～1.4 cm；小塊愈傷組織：＜0.7 cm。計算公式如下。

誘導率=產生愈傷組織個數/（總個數－污染數）×100%

污染率=（污染個數/接種個數）×100%

1.3 數據分析

數據采用SPSS 13.0 軟件進行顯著性比較及分析。

2 結果與分析

2.1 不同的消毒處理對展開葉片消毒效果的影響

不同處理對軟棗獼猴桃葉片消毒效果影響不同（表3）。從污染率可知處理8、處理9 與其他處理差異顯著，處理1 至處理4 差異不顯著；隨殺菌劑滅菌時間的增加，污染率與外植體死亡率逐漸下降。滅菌時間與外植體死亡率成正比。先以10.0% NaClO處理展葉20 min 后0.1% HgCl2處理10 min，污染率低、死亡數不斷減少，成活率較高，是最適合軟棗獼猴桃葉片的滅菌處理方案。

表3 不同消毒處理對軟棗獼猴桃葉片消毒效果的影響

2.2 不同培養基配方對葉片愈傷組織誘導效果

2.2.1 不同培養基配方對葉片愈傷組織誘導及萌發情況的影響 第8 天3 種母液培養基的葉片卷曲膨大，葉邊緣傷口處出現白色呈粘液質物體并形成愈傷組織，與王廣富等［17］的研究結論相似。選取生長調節劑KT 和2，4-D 進行配比，愈傷組織均為葉片膨大卷曲，在葉緣傷口處出現有白色的黏稠物質，隨著培養時間的增加，愈傷組織不斷向葉片內部擴大，直至整個葉片均形成愈傷組織。試驗分析可以得出，處理 3 中 1.00 mg/L KT 與 0.40 mg/L 2，4-D 這 2 種生長調節劑配比出來的軟棗獼猴桃葉片愈傷組織誘導率最高（表4），出現愈傷組織的用時較短，期間需控制生長調節劑濃度，過高則影響愈傷組織生長。

表4 不同培養基配方對軟棗獼猴桃葉片愈傷組織誘導及萌發情況的影響

2.2.2 不同培養基配方對軟棗獼猴桃葉片愈傷組織生長質量的影響 由表5 可知，培養15 d 后絕大多數的愈傷組織已形成，成活率大于60%；培養30 d 后愈傷組織單個平均質量為0.47 g，但未完全生長開，且長勢較緩慢；培養60 d 后單個愈傷組織平均質量為0.80 g，平均長度1.16 cm，屬于中塊愈傷組織，符合其他學者［13，18］研究得出形成愈傷組織的最佳長度應在0.70～1.40 cm 的結果，且葉片上的愈傷組織已全部長出，部分處理出現褐化。處理3 效果最優。

表5 不同培養基配方對軟棗獼猴桃葉片愈傷組織生長質量的影響

3 小結

經預試驗發現軟棗獼猴桃展葉更易在培養基里誘導出愈傷組織，而用嫩葉進行消毒處理，則會出現黃化枯萎現象，且誘導出的愈傷組織多數為黑化或褐化，生命周期短、污染率高，可能是因為在消毒過程中消毒劑對嫩葉產生刺激使葉片細胞死亡。本試驗以軟棗獼猴桃展葉為外植體，得出軟棗獼猴桃葉片的最佳消毒處理為：75.0% CH3CH2OH 處理葉片30 s，去 離 子 水 沖 洗 3～4 次 ，10.0% NaClO 處 理 20 min，去離子水沖洗 3～4 次后以 0.1% HgCl2處理 10 min。軟棗獼猴桃葉片愈傷組織誘導率最高且用時較短的培養基配方是MS+1.00 mg/L KT+0.40 mg/L 2，4-D+3.00%白糖+0.55%瓊脂，pH 5.8。將接種后的培養基置于光照強度2 500 lx，光照時間8 h/d，26 ℃下進行培養，8 d 后少部分愈傷組織出現，60 d后平均單個愈傷組織重量達0.80 g，單個愈傷組織平均長度1.16 cm，屬中塊愈傷組織，符合趙芮等［19］研究得出形成愈傷組織的最佳長度應在0.70～1.40 cm 的結論。

4 討論

由王廣富等［17］研究得出無芽莖段與葉片的愈傷組織誘導率均大于90%，且葉片不定芽分化率顯著高于莖段與葉柄，因此本試驗選取葉片為外植體進行研究。當前軟棗獼猴桃組培培養擴繁中，大都以莖與葉柄作為外植進行誘導，其葉片及根莖部分被直接剔除，大量葉片被浪費。將軟棗獼猴桃展葉作為組培外植體材料，可以有效減少資源的浪費，且以展葉為外植體進行擴繁，操作簡單便捷，培育成本低。試驗若選擇單一生長調節劑種類，則達不到預期的愈傷組織誘導率或難以誘導出愈傷組織。選取展葉為外植體，可有效避免在消毒過程中殺死葉片的表皮細胞。在愈傷組織培養過程中部分處理出現愈傷組織褐變，這與劉小剛等［15］的研究結果相似，出現褐變的原因可能為培養基消耗殆盡供不上營養；葉片消毒時間過長；接種過程中裁剪葉片帶入了病菌；培養環境溫度過高或濕度過大。如何控制軟棗獼猴桃愈傷組織褐變，可成為后續研究的重點。