不同磷形態對水稻根系細菌群落特征的影響

王 萌，范分良，易可可，徐 磊，徐 壯，張佳音，孟 莉，王 賽，李 旭，宋阿琳*

（1.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/農業農村部植物營養與肥料重點實驗室，北京 100081；2.中國富硒產業研究院，陜西 安康 725000）

磷（P）是植物正常生長代謝的重要元素之一，與植株體內糖、蛋白質和脂肪的代謝密切相關[1]。供磷不足會影響到植株體內的能量代謝過程，從而抑制植物的正常生長[2]。在土壤中，全磷質量分數一般在0.2～3 g/kg之間[3]，主要包括無機態磷和有機態磷[4-5]。磷主要以無機正磷酸鹽（Pi）的形式被植物根系吸收[6]，但土壤中70%～90%的無機磷會被土壤固化[7]，不能直接被植物吸收利用[8-9]。雖然施磷可以緩解土壤缺磷狀況[10]，但磷礦是不可再生資源[11]，其儲存量一直逐年下降[9]。并且過多的施用磷肥，還會造成水體富營養化等一系列的環境問題[12]。因此，提高植物對有機磷的利用率是解決植物缺磷的關鍵。研究表明，微生物在土壤磷素循環中起重要的作用[13]。土壤和根際中的多種微生物可通過溶解和礦化作用有效地從土壤總磷中釋放磷分子[14]，將其轉化為植物可利用的磷酸鹽，從而增加磷在植物中的吸收[15]。通過調控根際微生物改善作物生長發育已成為生態健康和農業發展研究的熱點。

根際是由植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的獨特土壤環境[16]，也是植物-土壤-微生物相互作用的場所，根際微生物被譽為植物的第二基因組[17-19]。在植物生長和發展過程中發揮著關鍵的作用[20-21]。大量研究表明，根際微生物受到各種生物或非生物因素的調控[22]，其中土壤類型起著決定性作用[23]。土壤理化性質、營養元素含量等因素都會影響植物根際微生物的構建，包括磷（P）、氮（N）和碳（C）也起著重要的作用[24-26]。例如，Sasaki等[27]通過高通量測序分析發現，氮肥對與根部相關的細菌群落的影響大于所研究植物基因型的影響。通過黃瓜和大麥在缺氮或缺磷的土壤中生長的短期試驗，Marschner等[28]發現根際中的細菌群落結構受土壤類型和施肥的影響，但不受植物物種的影響。還有報道指出，向玉米的根際添加少量無機磷可促進細菌對植酸的礦化作用，從而提高植物對磷的吸收[29]。綜上表明，磷對植物根際微生物具有顯著影響，但迄今不同磷形態如何影響植物根系微生物并不清楚。

因此，本研究選擇不同磷處理（不加磷、有機磷、無機磷）的土壤進行水稻盆栽試驗，利用高通量測序技術和生物信息學分析技術，探索不同磷形態處理下水稻根際細菌群落結構組成，通過分析對比非根際土、根際土以及根內環境中細菌在不加磷、有機磷和無機磷土壤環境下水稻根際細菌群落結構和多樣性差異，深入探究磷形態與水稻根際細菌群落的相互作用機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料與盆栽試驗

用干凈塑料袋分裝土壤，每袋3 kg。分裝完成的土壤共分為3組，其中，對照組為不施磷肥的低磷土壤；2個試驗組分別為添加有機磷肥的土壤和添加無機磷肥的土壤。每組進行5次重復，共計15個樣品。對照組按照N 200 mg/kg、KCl 125 mg/kg添加養分；有機磷試驗組按照N 200 mg/kg、KCl 125 mg/kg、植酸 C6H18O24P6，0.5 mL/kg添 加 養 分；無 機 磷 試 驗 組 按 照N 200 mg/kg、K 125 mg/kg、P 100 mg/kg添加養分。含水量調節至田間持水量的60%，充分混勻。

表1 供試土壤基本理化性質

將塑料袋直接放入盆中。選擇質量相近、外形相似的水稻種子（供試品種為秈稻kasalath）。為避免種子內生菌和表面相關微生物的影響，種子須進行脫殼處理。水稻種子先在75%的乙醇中消毒30 s；然后用2.5%的次氯酸鈉溶液消毒3次，每次15 min；最后用無菌去離子水將種子清洗5遍，將其置于MS 瓊脂培養基中培養萌發[30]。待幼苗長至7 cm左右，移栽至準備好的盆中，每盆種4株水稻。幼苗長至10 cm及以上時進行間苗，每盆最終保留2株長勢均勻的幼苗。盆栽試驗在溫室中進行，并定期隨機調換盆栽的位置。

1.2 樣品采集

培育8周后，采集水稻地上部、根系、根際土，同時采集少根土壤作為非根際土壤。具體操作如下：將整株水稻從盆中取出，收集水稻根，用無菌水洗掉粘在水稻根上的松散顆粒，經過渦旋振蕩將附著于根系表面的土壤清洗至滅菌的去離子水中，該部分土樣即為根際土，用無菌濾紙吸干根部，最后將根和根際土于-20℃中保存。

1.3 土壤基本理化性質的測定

土壤有效磷、磷酸酶活性、植株全磷的測定方法參照文獻[31]。

1.4 DNA樣品提取及高通量測序

稱取0.5 g保存于-20℃的土壤樣品，用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒和Fast Prep-24核酸提取儀（MP Biomedicals，USA）提取土壤總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA提取質量并用NanoDrop 2000檢測其濃度，保存于-20℃冰箱備用。

將提取的DNA原液稀釋至約5 mg/L作為PCR 擴增模板。用引物799F和1193R對細菌16S rRNA V5～V7可變區序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增（表2）。擴增體系共計50 μL，包含5 μL 10×buffer、4 μL dNTP、0.5 μL rTaq（Takara）、10 μmol/L 的前后引物各1 μL、36.5 μL ddH2O和2 μL模板DNA，每個樣品3次重復。擴增程序為：在98℃預變性30 s，98℃解鏈10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。將3個重復的DNA擴增產物混勻后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗。用PicoGreen試劑盒測定所得細菌PCR 產物濃度，將產物等量混勻后，采用DNA純化試劑盒（TIANGEN Biotech，Beijing，China）進行純化回收。通過Illumina Hiseq2500平臺進行細菌16S序列測定。

表2 用于擴增16S rRNA基因的引物序列

1.5 數據處理與分析

高通量序列用USEARCH軟件包分析[32]，首先除去質量分數低于20以及與引物存在不一致的序列，再將剩余高質量序列統一修剪至250 bp[33]。以97%的相似性水平用UPARSE進行OTU聚類[34]，序列中的嵌合體用UCHIME過濾，以85%的置信水 平 為 標 準，在RDP（http：//pyro.cme.msu.edu/）平臺進行物種分類注釋，并在各個分類水平上統計每個樣品的群落組成。

采用Excel 2010和SPSS 21.0進行數據統計分析和單因素ANOVA方差分析；利用 Duncan法進行多重比較（P＜0.05）。用R語言的vegen包進行多樣性計算和principal co-ordinates analysis（PCoA）分析，用DESeq2包分析不同磷處理下細菌種水平的顯著差異，并用ComplexHeatmap包繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同磷處理下水稻生長和土壤基本化學性質的差異

如表3所示，水稻土壤在不同磷處理下，除地上部生物量（干重）外，土壤有效磷含量、磷酸酶活性以及植株地上部全磷含量指標均存在顯著差異。有機磷和無機磷處理有效磷含量明顯高于不加磷（對照）處理，且無機磷處理下土壤中有效磷含量最高，為49.39 mg/kg。磷酸酶活性從高到低依次為有機磷處理＞無機磷處理＞不加磷處理，其中無機磷、有機磷與不加磷處理之間存在顯著性差異。與不加磷處理植株地上部全磷含量相比，無機磷處理的植株全磷含量顯著提高。

表3 不同磷處理下水稻生長和土壤的基本理化性質

2.2 不同磷處理下水稻細菌群落的α多樣性

由表4可知，不同根系分區土壤的細菌豐富度在842～1276范圍內變動，其中不加磷處理的非根際土壤細菌豐富度最高，與根系和根際土壤中細菌豐富度差異顯著（P＜0.05）；從ACE、Chao指數來看，在所有處理中根際土與非根際土中微生物群落的豐富度遠遠高于根系，差異達到顯著水平（P＜0.05），其中細菌豐富度大小順序為非根際土＞根際土＞根系。通過比較不同磷形態下的細菌群落多樣性發現，與不加磷處理相比，有機磷和無機磷處理的細菌群落多樣性有所下降，但差異沒有達到顯著水平（P＞0.05）。通過雙因素方差分析可知，不同磷處理和不同部位對微生物群落α 多樣性均有顯著影響（P＜0.05），但兩者之間的交互作用僅對Simpson指數有顯著影響（P＜0.05），對其他指數影響不顯著（P＞0.05）。

表4 不同磷處理下水稻細菌群落的α多樣性

2.3 不同磷形態水稻細菌群落多樣性和結構

由圖1可知，在所有處理中，非根際土壤微生物群落多樣性高于根際土壤中微生物和根系微生物群落多樣性。根際土壤中，有機磷與不施磷處理差異不顯著，無機磷處理顯著降低了細菌群落多樣性；而非根際土壤中，與不施磷相比，施磷處理顯著降低土壤細菌群落多樣性，有機磷處理細菌群落多樣性大于無機磷處理。

圖1 不同磷形態水稻細菌Shannon指數

基于97%相似度的OTU數據，采用weighted Unifrac算法分別對不同磷處理下根際土壤、非根際土壤及根系細菌微生物群落結構進行了主坐標分析（PCoA）。由圖2可知，第一主成分和第二主成分的方差貢獻率分別為22.43%和14.06%，累計方差貢獻率為36.49%。結果顯示，在第一主坐標軸（PCoA1）上，細菌微生物組按照分布部位的不同被分為了兩簇，其中根系細菌群落結構與根際及非根際土壤細菌群落結構在PCoA1軸上明顯分開，這表明分布部位的不同是細菌群落差異的最主要因素。

圖2 不同磷形態水稻細菌群落主坐標分析

不同磷處理下不同根系分區土壤細菌在門水平的豐度分析（圖3）顯示，各處理間相對豐度較高的菌屬包括厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸 桿 菌 門（Acidobacteria）、Ignavibacteriae、綠彎菌門（Chloroflexi），在根際土壤不加磷、有機磷、無機磷處理下厚壁菌門（Firmicutes）的群落相對豐度分別是59.4%、61.0%、66.6%；變形菌門（Proteobacteria）的群落相對豐度分別是22.2%、23.5%、16.5%；放線菌門（Actinobacteria）的群落相對豐度分別是8.7%、7.3%、10.1%；酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度分別是2.5%、2.1%、2.3%；綠彎菌門（Chloroflexi）群落相對豐度分別是0.8%、0.5%、0.6%；在非根際土壤中不加磷、有機磷、無機磷處理下厚壁菌門（Firmicutes）的群落相對豐度分別是28.4%、34.4%、41.6%；變形菌門（Proteobacteria）的群落相對豐度分別是22.2%、23.5%、16.5%；放線菌門（Actinobacteria）的群落相對豐度分別是8.7%、7.3%、0.1%；酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度分別是2.5%、2.1%、2.3%；綠彎菌門（Chloroflexi）的群落相對豐度分別是1.5%、1.3%、1.3%；在根內中不加磷、有機磷、無機磷處理下厚壁菌門（Firmicutes）的群落相對豐度分別是36.2%、17.2%、31.0%；變形菌門（Proteobacteria）的群落相對豐度分別是41.0%、51.1%、38.5%；放線菌門（Actinobacteria）的群落相對豐度分別是17.3%、27.5%、26.5%；酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度分別是0.6%、0.5%、0.5%；綠彎菌門（Chloroflexi）的群落相對豐度分別是0.3%、0.3%、0.4%。

圖3 不同磷形態水稻細菌群落在門水平分布組成

為了比較不同磷形態下細菌菌屬差異，將無機磷、有機磷處理分別與不加磷處理主要細菌在科水平下做了比較，其相關性和差異性揭示了磷形態對根系微生物的影響。從圖4可以看出，不同處理中細菌群落組成差異顯著且區分明顯。例如，無機磷處理與不加磷、有機磷處理相比較，在根系和根際土壤中微桿菌科（Microbacteriaceae）、鏈霉菌科（Streptomycetaceae）相對豐度較低，高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae）顯著高于不加磷和有機磷處理，其中芽孢桿菌科（Bacillaceae）在根際、非根際土壤及根系相對豐度均低于不加磷和有機磷處理。

圖4 不同磷形態下細菌熱圖

從表5可以看出，根際土細菌多樣性與植株地上部全磷含量呈極顯著負相關；根系細菌多樣性與地上部生物量呈極顯著負相關（P＜0.01），與有效磷含量和磷酸酶活性呈顯著負相關（P＜0.05）；根系細菌豐富度與有效磷呈顯著負相關：非根際土壤細菌多樣性與有效磷含量呈極顯著負相關，與磷酸酶活性和植株地上部全磷含量呈顯著負相關。

表5 細菌多樣性與土壤理化性質的相關性分析

3 討論

3.1 不同磷形態對土壤理化性質的影響

與不加磷相比，有機磷和無機磷處理顯著增加土壤有效磷含量和磷酸酶活性。其中有機磷處理下的磷酸酶活性最高，有效磷含量最高的是無機磷處理。與不加磷相比，無機磷處理對植株地上部全磷含量具有顯著促進作用。有機磷處理與無機磷和不加磷處理均沒有顯著性差異。值得注意的是，在有機磷處理中，土壤有效磷含量和磷酸酶活性均顯著高于不加磷處理，與無機磷處理沒有顯著性差異，這可能是因為植物在有機磷含量較高的環境下，植物根系分泌的大量磷酸酶和有機酸通過酶催化水解作用，將植物不可吸收的磷轉化成可溶態磷，增加了土壤中有效磷含量，彌補了植物無法從有機磷中直接獲取磷的能力[35-36]，所以植株全磷含量與無機磷處理相比沒有顯著性差異。

3.2 磷形態對根際細菌群落的調控作用

微生物群落受到各種生物因素和非生物因素的調控[37-40]，從而對植物生長發育產生一定的影響，不同植物物種在低磷脅迫下會產生不同的微生物響應[41-45]，比如研究發現不同磷水平對擬南芥、柳枝[46]、黑麥草[47]根際細菌微生物組沒有影響[48]。但是在玉米中，施入磷肥豐富了根際細菌的多樣性并改變了細菌群落組成[18]。而在本研究中，通過對不同磷處理水稻的不同根系分區細菌群落多樣性（圖1）的分析發現，與不加磷處理相比，有機磷處理對根際土壤和根系細菌群落多樣性的影響不顯著，無機磷處理的細菌多樣性顯著降低，并且在不同門水平和科水平下細菌類群也存在一定的差異（圖3、4）。比較科水平下不同磷形態細菌差異，無機磷處理與不加磷、有機磷處理相比較，在根系和根際土壤中微桿菌科（Microbacteriaceae）、鏈霉菌科（Streptomycetaceae）相對豐度較低，值得注意的是，芽孢桿菌科（Bacillaceae）在根際、非根際土壤及根系相對豐度均低于不加磷和有機磷處理。通過查閱文獻了解到，芽孢桿菌屬（Bacillus）是土壤中主要的磷酸鹽增溶細菌（PSB），可以將植物無法利用的磷酸鹽轉化為其可溶形式，從而通過在土壤根際分泌有機酸（例如檸檬酸、草酸、琥珀酸、酒石酸和蘋果酸）來提高磷的利用率。這也就解釋了為什么Bacillaceae更多地富集在不加磷和有機磷處理的根系周圍。植物根系是吸收磷的主要器官，在缺磷條件下根系會釋放出各種根系分泌物、植物激素等[49]，其中部分代謝產物可能會提高細菌的轉化率，豐富細菌群落多樣性從而提高細菌群落對有機磷的分解和轉化利用，而且在可溶態磷酸鹽充足的環境下，有機磷的轉化水解作用受到一定的抑制。這也說明了水稻根際土和根內細菌群落的構建受到低磷脅迫的影響和調控。

3.3 根系對根內微生物的調控作用

本研究對樣品間Bray-Curtis距離進行了非限制性主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）（圖2），結果顯示，在第一主坐標軸（PCoA1）上水稻的微生物組按照不同根系分區被分為了兩簇，表明在不同根系分區水稻細菌群落組成不同。此外，通過比較樣品中的物種豐富度，發現在不同磷處理下根系、根際及非根際土壤細菌群落的物種豐富度沒有顯著性差異，不加磷和有機磷處理比無機磷處理水稻細菌物種豐富度稍高。但是同一處理下非根際與根際土壤及根系的細菌物種豐富度和多樣性呈顯著性差異，根際土壤細菌豐富度指數也顯著高于根系細菌豐富度指數，說明僅有部分細菌菌屬進入根內生長。通過比較根系和根際土壤細菌的優勢菌門，發現厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對豐度均比較高，這也表明與根相關的細菌群落結構主要來自土壤中的細菌群落[50-51]，但是放線菌門（Proteobacteria）在根系相對豐度高于根際土壤，酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度在非根際土壤、根際土壤、根系呈遞減趨勢，說明根系對細菌群落起到過濾篩選作用。綜上所述，土壤細菌群落與根內細菌之間存在密切聯系[52]，根系對進入根內微生物具有調控作用并且根內細菌群落特異性更高[53]，多樣性較低[54]。

4 結論

不同磷形態改變了水稻土壤理化性質，微生物群落結構與組成也存在顯著性差異，其中無機磷處理差異更為顯著。施入磷肥，對于提高土壤有效磷含量和磷酸酶活性具有重要作用，并且土壤理化性質的改變對微生物群落結構也有一定影響，無機磷處理下細菌群落多樣性顯著降低，有機磷影響不顯著。在不同根系分區中非根際土壤、根系和根際土壤細菌群落結構多樣性、豐富度呈顯著性差異，根系對進入根內細菌具有選擇調控作用。本研究結果從多角度反映了不同磷形態對水稻細菌群落結構調控作用，為進一步探究磷形態與水稻微生物群落結構的相互作用機制提供了理論基礎。