樟子松幼苗對接種外生菌根真菌與指數施肥的響應

王嘉月，郝龍飛，白淑蘭*，包會嘎

（1.內蒙古農業大學林學院，內蒙古 呼和浩特 010019；2.烏海市濕地管理局，內蒙古 烏海 016000）

苗木質量是影響苗木造林與生長的重要因素，在苗木培育中，施肥是提高苗木質量的有效手段之一。有研究發現施用肥料有助于提高農、林業產量[1-2]，但不同施肥方式對苗木的促生作用存在較大差異。目前，苗木培育常采用的施肥方法有常規施肥（CF）和指數施肥（EF）。常規施肥是指在生長季內重復施用等量的肥料或集中一次施用大量肥料。指數施肥則是指基于“養分承載理論”的一種按指數遞增供給苗木養分的施肥方式，其符合苗木生長階段的需肥規律，并能誘導苗木奢侈耗養，從而提高養分承載[3-5]。有研究發現，指數施肥的苗木能更好地適應造林地環境，與常規施肥相比苗木具有更高的成活率[6]。自20世紀80年代瑞典農業科技大學的Ingestad等[3，7]通過試驗研究創立“指數養分承載理論”（exponential nutrient loading theory）以來，指數施肥技術在國外得到推廣應用。如今，指數施肥技術培育出的苗木對維護當地生態平衡、改善土壤養分結構、廢棄地植被恢復均有較大貢獻[8]。我國關于指數施肥研究開始于20世紀80年代，目前已開展了對沉香（Aquilaria agallocha）、楸樹（Catalpa bungei）、栓皮櫟（Quercus variabilis）、油松（Piuns tabulaeformis）、白樺（Betula platyphylla）等多個重要樹種的指數施肥研究，取得了一定的成果[9-14]。

菌根是自然界中一種普遍存在的植物共生現象[15]，它可以擴大宿主植物根系的吸收面積，增加宿主植物對養分的吸收，同時，菌根真菌還能產生植物生長調節物質，例如生長素（Auxin）、細胞分裂素（Cytodinin）、赤霉素（Gibbereline）、脫落酸（Abscisicacid）等，促進宿主植物的生長和提高其抗逆性[16-18]。近些年，我國對菌根真菌的研究逐步深入，從菌根真菌資源多樣性研究到對共生植物促進機制研究，均取得了一定成果[19-22]。

樟子松（Pinus sylvestrisvar. mongolica）是我國半干旱風沙地區植樹造林的先鋒樹種，研究發現，能與樟子松形成外生菌根的菌根真菌種類較多，如彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）、粘蓋牛肝菌（Suillus bovinus）、淺黃根須腹菌（Rhizopogon luteolus）等[20，23]。目前，樟子松菌根化育苗技術的研究與推廣應用較為廣泛，但在菌根化育苗生產中，仍然廣泛采用的是常規施肥方法，這不僅造成嚴重的肥料浪費和土壤的富養化，同時也不符合苗木的養分需求規律，在林木菌根化育苗過程中如何運用指數施肥技術國內也鮮見報道。本研究以2年生樟子松苗圃苗為試驗材料，設置接種外生菌根真菌與指數施肥處理，探討在兩種因素影響下苗木的生長情況，以提高苗木質量，為培育高質量樟子松菌根化育苗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗地設在內蒙古農業大學林學院試驗苗圃，該地屬于中溫帶大陸性季風氣候，四季氣候變化明顯且差異較大，年平均氣溫為6.7℃，年平均降水量為400 mm左右，土壤類型為潮土，無霜期為113～134 d。

試驗材料為2年生樟子松苗圃苗，幼苗購買于呼和浩特市托克托縣城關苗圃。2018年秋季移栽幼苗并接種菌劑。選用的菌種原種采集于內蒙古大青山地區，后于實驗室鑒定分離。選用生長健壯的平板菌種制作固體菌劑[20]，供試菌種見表1，試驗用地土壤pH值為7.63，土壤水解氮、速效鉀、有效磷分別為30.15、117.42、7.82 mg·kg-1。

表1 供試菌種名錄

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗區劃分

將40 m2的試驗用地平整后設置為18個1 m×1 m的樣地，為防止試驗處理后不同處理的相互干擾，將相鄰的兩個地塊之間用PVC隔板隔開。PVC隔板地下埋藏深度為40 cm，地上露出10 cm。每個樣地選用長勢一致的2年生樟子松幼苗25株，其株行距為20 cm，共計450株。試驗采用完全區組設計，每6個樣地為一個區組，每個區組在接菌與不接菌的基礎上設置3種施肥處理，即接菌設置：指數施肥（JEF）、2倍指數施肥（JDEF）、常規施肥（JCF）；不接菌設置：指數施肥（EF）、2倍指數施肥（DEF）、常規施肥（CF），共計6個處理，每個處理均重復3次。

1.2.2 試驗處理

接菌處理：試驗共選用8個菌種，在移栽幼苗的同時進行接菌處理。將制備好的菌劑等量混合攪拌均勻后放入接菌處理幼苗坑穴底部，使其與幼苗根系緊密接觸，每株幼苗接種量為30 g。在接菌約8個月后每個處理隨機選取1株幼苗測定菌根侵染率[21]。

施肥處理：施肥從2019年5月初（接菌9個月后）開始到8月中旬結束，施肥間隔為2周，共計8次施肥。具體施肥時間見表2。試驗采用Timmer[4]提出的指數施肥模型計算每次相應的施肥量，公式如下：

式中，NT表示生長結束時苗木體內的養分；NS表示苗木初期養分含量；r表示養分相對添加速率；t表示施肥次數；Nt表示第t次的施肥量；Nt-1表示第t-1次的總施肥量。

試驗開始前測定生長季初期苗木體內氮含量為68.28 mg·株-1，利用公式（1）、（2）計算出指數施肥（EF）和2倍指數施肥（DEF）每次的施肥量（表2）。常規施肥（CF）是根據植物營養生長規律在第1次和第5次（營養生長和生殖生長）分兩次集中施入。肥料選用尿素[CO（NH2）2含N 46%]，為保證苗木養分平衡，加入KH2PO4以補充P、K肥，施入量為10 mg·株-1，隨尿素一同施入，共計80 mg·株-1。施肥方法為：用小鏟在距離幼苗根部5 cm左右挖1～2 cm深的環溝，將事先稱量好的肥料溶于水中，用量筒對各處理的幼苗沿環溝等量澆灌，然后將環溝覆平[24]。

表2 樟子松不同施肥處理的施肥時間和施肥量 （mg·株-1）

1.3 指標測定

生長指標測定：施肥結束一周后取樣，每個處理隨機取3株幼苗，分別用卷尺和游標卡尺測量苗高、地徑。將幼苗帶回實驗室用蒸餾水清洗，按根、莖、葉分開并裝入信封放入烘箱內，在105℃下殺青30 min，在80℃下烘干至恒重。烘干后稱取幼苗根、莖、葉生物量，總生物量=根生物量+莖生物量+葉生物量。根據生物量計算苗木質量指數[25]。

植物N、P測定：將烘干后的植株按地上、地下部分混合，研磨后分別采用凱氏定氮法測定全N，鉬銻抗比色法測定全P。N（P）積累量（g·株-1）=幼苗N（P）質量分數（g·kg-1）×不同器官相應生物量（g·株-1），總N（P）積累量=地上部分N（P）積累量+地下部分N（P）積累量。

菌根侵染率測定：外生菌根侵染率采用統計計算法。將根樣剪成1 cm左右等長的根段，隨機選取根樣，每個處理100個根段，在體視鏡下觀察外生菌根侵染率[21]。菌根侵染率（%）=（有菌根根段數/總根段數）×100。

1.4 數據分析

采用Excel 2016和SPSS 18.0進行數據處理，使用SigmaPlot 14.0進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同處理對菌根侵染率的影響

在苗圃條件下，接菌處理與不接菌處理的幼苗均與外生菌根真菌形成了菌根，但接菌處理的幼苗菌根侵染率顯著大于不接菌處理（表3）。在施肥結束后，JEF與JDEF處理幼苗的菌根侵染率與JCF相比均增加了21.1%（P＜0.05），但JEF與JDEF處理之間差異不顯著（P＞0.05）。而DEF處理幼苗菌根侵染率較CF處理增加了17.0%（P＜0.05），DEF與EF處理則差異不顯著（P＞0.05）（表3）。對菌根侵染率進行雙因素方差分析，施肥處理和接菌處理對菌根侵染率有極顯著影響，但二者的交互作用不顯著。

表3 菌根侵染率 （%）

2.2 不同處理對幼苗苗高、地徑的影響

在施肥結束后，JEF處理的苗高最大（表4），為30.73 cm，顯著高于其他施肥處理（P＜0.05），分別 是JDEF、JCF處 理 的1.13和1.30倍。EF與DEF處理差異不顯著（P＞0.05）（表4），但均與CF處理差異顯著。不同施肥處理對幼苗地徑的影響與對苗高的影響規律一致。其中，JEF與JDEF地徑無顯著差異，而與其他施肥處理均存在顯著差異（P＜0.05）。由表4可以看出，JEF處理地徑較JCF處理增加了32.3%，達顯著差異（P＜0.05）。在不接菌處理中，EF和DEF處理地徑較CF處理分別增加了22.3%、18.8%，均存在顯著差異（P＜0.05），而EF與DEF處理無顯著差異（P＞0.05）。這表明與常規施肥相比，指數施肥對幼苗苗高、地徑生長更有利。從表4還可以看出，JEF效果更佳，一方面對生長促進效果好，另一方面也可以減少肥料的浪費。對幼苗苗高、地徑進行雙因素方差分析（表4）表明，施肥處理、接菌處理對幼苗苗高、地徑影響均達顯著水平（P＜0.01），施肥和接菌處理的交互作用對苗高影響顯著（P＜0.05），對地徑影響則不顯著（P＞0.05）。

表4 不同施肥處理對各指標的影響

2.3 不同處理對幼苗生物量的影響

不同施肥處理均促進了樟子松幼苗生物量積累。施肥結束后，不同處理的幼苗生物量大小依次 為JEF＞JDEF＞JCF＞EF＞DEF＞CF（ 表4）。JEF處理幼苗生物量較EF、JDEF、DEF、JCF、CF處理 分 別 增 加 了51.8%、18.0%、60.3%、36.9%、102.6%，均達顯著差異（P＜0.05）；對不接菌苗來說，EF處理與DEF處理差異不顯著（P＞0.05），但二者均與CF處理差異顯著（P＜0.05），生物量分別增加了33.5%、26.4%，說明指數施肥對苗木生長有利。同時，對幼苗生物量進行雙因素方差分析（表4），發現施肥和接菌處理對幼苗生物量大小影響極顯著（P＜0.001），施肥和接菌處理的交互作用對生物量影響顯著（P＜0.05），表明接種菌根真菌后采用指數施肥對樟子松幼苗生物量的積累有積極作用。除JEF處理外，不同施肥處理幼苗各器官生物量大小依次為葉＞莖＞根（表4）。JEF處理根生物量最大，且顯著高于其他施肥處理，最小的則是CF處理，為5.53 g；葉生物量與根生物量規律一致，JEF處理莖生物量最大，除JDEF外顯著高于其他處理。對幼苗根、莖、葉生物量進行雙因素方差分析（表4）表明，施肥、接菌處理及二者交互作用對幼苗根、葉生物量影響均達顯著差異（P＜0.01），而施肥、接菌處理對莖生物量有顯著影響（P＜0.05），而二者交互作用對其無顯著影響（P＞0.05）。

2.4 不同處理對幼苗N、P積累的影響

研究發現在相同的施肥處理下，接菌處理幼苗總N、P積累量均顯著大于不接菌處理（P＜0.05）。多重比較結果表明，在接菌與不接菌處理下，EF、DEF處理幼苗總N積累量均與CF處理有顯著差異（P＜0.05），而EF、DEF之間差異不顯著（P＞0.05）（圖1）。JEF、JDEF、JCF處理幼苗總P積累量均差異顯著（圖2），而不接菌幼苗EF與CF處理間差異顯著。試驗結束后，JEF與EF處理幼苗N積累量較CF處理分別增加了96.4%、38.0%，P積累量較CF處理分別增加了100.7%、21.4%，表明指數施肥與外生菌根真菌二者的雙重作用更能促進苗木N、P養分積累。JEF處理地上、地下部分N積累量最大，分別為0.51、0.11 g，均顯著大于其他處理；JEF處理地上、地下部分P積累量最大，分別為41.12、16.03 mg，均顯著大于其他處理。

圖1 不同施肥處理的幼苗N積累量

圖2 不同施肥處理的幼苗P積累量

2.5 不同處理對幼苗地上、地下部分N、P積累分配的影響

不同施肥處理下，地上部分N積累分配比例為JDEF＞EF＞CF＞DEF＞JCF＞JEF（圖3），地下部分N積累分配比例為JEF＞JCF＞DEF＞CF＞EF＞JDEF；幼苗地上、地下部分P積累分配比例與N積累分配規律一致（圖4）。顯然，幼苗地上部分養分所占比例遠大于地下部分，其中，JDEF處理地上部分N、P積累所占比例均最大，JEF處理地下部分N、P積累所占比例也最大，表明接種菌根真菌和指數施肥處理的幼苗對養分分配有積極影響，從而促進幼苗吸收養分。

圖3 不同施肥處理的N分配比例

圖4 不同施肥處理的P分配比例

3 討論

3.1 不同施肥處理對幼苗菌根侵染率的影響

本研究中接菌與不接菌處理的幼苗均被外生菌根真菌侵染，這可能是因為原來苗圃土壤中存在大量土著外生菌根真菌，在幼苗移栽前就已經侵染了苗木，但這些土著菌根真菌的作用如何本研究尚未涉及，在今后的研究中有待于進一步探索。對菌根侵染率進行雙因素方差分析，施肥處理和接菌處理對菌根侵染率均有極顯著影響，但二者的交互作用影響不顯著。這可能是因為不接菌處理的幼苗實際上也被菌根真菌侵染，與接菌處理的幼苗相比，施肥和接菌處理的交互作用相差不大，不能明確判斷2種處理的交互作用對菌根侵染率的影響；此外，指數施肥在苗木生長后期供肥量較大時是否會對菌根有制約作用，也還需要后續試驗來進一步探討。

3.2 不同施肥處理對幼苗生長的影響

苗高、地徑、生物量是評價苗木質量好壞的重要指標。劉歡等[24]報道了指數施肥提高1年生杉木苗高、地徑；Iverson[26]認為，苗木生物量越大，競爭能力越強，其在困難立地條件下的存活率越高，而適量的施肥可以提高植物幼苗N、P養分含量，從而影響幼苗生物量積累。通過雙因素方差分析發現，施肥處理和接菌處理對苗木苗高、地徑、生物量的影響均達顯著水平（P＜0.05），而二者交互作用僅對幼苗苗高、生物量影響顯著（P＜0.05），與指數施肥能促進美國山核桃幼苗[27]、紫椴幼苗[25]、油松容器苗[28]苗木生長的報道相類似。隨著施肥量的增加，苗高、地徑、生物量等指標不增反降（表4），施肥結束后，在接菌處理下，指數施肥處理幼苗苗高、地徑、生物量均大于二倍指數施肥，同時，二者又都大于常規施肥，其中，JEF處理幼苗各指標均達最大，這表明指數施肥和接菌處理的交互作用更能促進幼苗生長。接菌苗和不接菌苗苗木質量指數的大小均為EF＞DEF＞CF，原因為幼苗在生長初期根系還未發育完全，常規施肥處理供給幼苗的養分不能被充分利用，甚至會在一定程度上制約幼苗根系的生長，這既造成養分的浪費，也影響幼苗苗高、地徑、生物量。幼苗生長至速生期時，常規施肥處理不能供給幼苗足夠的養分，進而制約幼苗的生長。指數施肥由于符合苗木生長規律，在幼苗生長初期，養分供給較少，卻已基本滿足了幼苗的養分需求，此時養分充足的幼苗不需要將更多的光合產物分配到根系，而是用于地上部分的生長，而幼苗地上部分越健壯則對光合作用越有利，繼而提高生物量積累。且較少的肥量在一定程度上可以誘導根系的生長，從而增加地下部分生物量，同時，也避免養分的浪費。在本試驗中，幼苗根、葉對指數施肥和接菌處理更敏感也與此規律符合。Hodge[29]的研究也表明，少量氮肥對早期根系發育至關重要，它能更有效地促進根系的生長，從而獲取更多的養分。隨著生長幼苗對養分的需求逐漸遞增，指數施肥提供的肥量也隨之增大，滿足了幼苗生長所需的養分，從而加速幼苗生長。指數施肥按照指數遞增的方式供給苗木養分，符合苗木在各個生長階段的需肥規律，并誘導苗木奢侈耗養，與常規施肥相比更有利于苗木生長。

3.3 不同施肥處理對幼苗N、P養分積累的影響

祝燕等[30]認為苗木施肥能顯著提高幼苗各器官的氮積累量。朱小樓等[31]研究表明氮素指數施肥有利于落羽杉幼苗養分的積累。在本試驗中，接菌或不接菌處理幼苗總N、P養分積累量均為EF＞DEF＞CF，表明指數施肥好于常規施肥，但也要適量，不能設置過大的濃度。Salifu等[32]研究發現，當幼苗養分供不應求或充足時，苗木養分積累量隨氮素的增加而增加；當氮素供給超過苗木的最佳需求時，養分積累量不會繼續增加，甚至會下降。在本試驗中JDEF與DEF處理幼苗N、P養分積累量分別小于JEF與EF處理，可能是因為DEF處理提供的肥量超過了幼苗的最佳需求，以致對幼苗產生了輕微毒害，但還未過于制約幼苗生長，但同時也明顯看出造成了養分浪費。這也與王益明等[33]、王曉等[34]研究相似。此外，與劉歡等[24]研究發現杉木無性系幼苗根中氮所占比例為對照＞常規施肥＞指數施肥的結果不同。本試驗中，不接菌CF處理地下部分N分配比例大于EF處理，而接菌處理則與此相反，為JEF＞JCF。幼苗地下部分P分配規律與N相同，這一方面表明常規施肥在幼苗生長后期養分供應量不能滿足其生長需求，幼苗將養分由地上部分轉移至地下部分，從而促進根系生長進而獲得更多養分；另一方面表明菌根真菌與幼苗根系形成菌根后，提高了養分吸收效率，而指數施肥與常規施肥相比更符合幼苗的生長規律，因此，接種菌根真菌與指數施肥二者的交互作用對幼苗產生了更積極的影響。

4 結論

幼苗形成菌根后增強了養分的吸收；與常規施肥相比指數施肥更能促進幼苗生長；另外，接菌與施肥處理二者交互作用均顯著提高幼苗的生長和生物體內更多N、P養分積累。

接菌與不接菌處理下，二倍指數施肥處理對幼苗各指標的促進作用低于指數施肥，為了避免造成肥料的浪費，建議在樟子松菌根化育苗過程中采用指數施肥更為合理。