氨基柱高效液相色譜法檢測大豆提取物中的磷脂酰膽堿

王 瑞， 段旭林， 張琦弦， 呂遠平， 何 強， 遲原龍

(四川大學輕工科學與工程學院，四川 成都 610065)

0 引 言

磷脂作為一種復合脂，是指含有磷酸的脂類。其作為一種從動植物組織中提取得到的混合物，主要由磷脂酰膽堿（phosphatidylcholines, PC）、磷脂酰肌 醇 （phosphatidyl inositol, PI） 、 磷 脂 酰 乙 醇 胺（phosphatidyl ethanolamine, PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）、鞘磷脂（sphingomyelin,SM）[1]等成分構成。其中，磷脂酰膽堿具有提高記憶力[2]、降低血清膽固醇[3]、抗氧化[4]等多種功效，在食品、畜牧業、醫藥、化妝品等領域[5-8]有著較為廣泛的應用。

目前，磷脂酰膽堿的檢測方法有高效液相色譜法[9]、鉬藍比色法[10]、薄層色譜法[11]、核磁共振法[12]等。鉬藍比色法檢測的是總磷脂含量，薄層色譜法進行的是半定量分析且干擾因素較多，核磁共振法會對磷脂分子造成破壞，檢測成本高，存在一定的局限性。與這些方法相比，高效液相色譜法同時兼具操作簡單、不會破壞磷脂分子等優點，近年來在檢測磷脂酰膽堿方面應用得較為廣泛。而磷脂酰膽堿作為一種極性脂，十八烷基鍵合硅膠色譜柱（C18）等反相色譜柱對其保留、分離能力較弱。在目前相關研究中，所用的分離色譜柱主要集中在硅膠柱，硅膠柱的極性很強，是一種正相色譜柱，流動相多采用正己烷-異丙醇-水/酸等三元體系，較為繁瑣[13-15]。氨基柱是一種以硅膠為基質，表面鍵合了氨丙基的色譜柱。與硅膠柱相比，氨基柱的極性更弱，可同時適用于正相和反相溶劑，且可基于極性吸附和弱陰離子交換兩種作用對分離物質達到保留作用。本實驗采用氨基色譜柱在反相條件下對大豆提取物中的磷脂酰膽堿進行檢測，以極性較強的乙腈-水二元體系作為流動相，旨在提供一種簡單、快速的磷脂酰膽堿檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（市購）；乙腈（色譜級，美國Sigma公司）；丙酮（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；乙醇（分析純，成都金山化學試劑有限公司）；磷脂酰膽堿標準品（P7443，純度≥99%，美國Sigma公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；SHISEIDO CAPCELL PAK UG80 氨基柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；FA2204C電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；TGL-16型冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：氨基柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=80∶20（V/V）；檢測波長：206 nm；流量：0.8 mL/min；進樣量：50 μL；柱溫：30 ℃；以峰面積為指標進行定量分析。

1.3.2 標準溶液的制備

準確稱取磷脂酰膽堿標準品9.68 mg，用無水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，搖勻，制得質量濃度為96.80 mg/L的標準母液。準確吸取磷脂酰膽堿標準母液 4，8，12，16，20 mL，用無水乙醇進行梯度稀釋，得到質量濃度分別為7.744，15.488，23.232，30.976，38.720 mg/L 的磷脂酰膽堿標準工作液。置冰箱中–20 ℃儲藏備用。

1.3.3 大豆提取物的制備

將大豆洗凈干燥后，粉碎，100目過篩，得到大豆粉。準確稱取大豆粉60.08 g，加入3倍體積丙酮脫脂，得到脫脂大豆粉。按料液比為8∶1（mL/g）加入無水乙醇超聲提取1 h，離心分離上清液。將上清液于40 ℃進行旋轉蒸發濃縮，并用4 ℃的丙酮沉降。將得到的沉淀物真空干燥后，即得到粉末狀的大豆提取物。

1.3.4 提取物待測溶液的制備

準確稱取大豆提取物10 mg，用無水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，經0.45 μm的微孔濾膜過濾，置冰箱中–20 ℃儲藏備用。

1.3.5 大豆提取物中磷脂酰膽堿含量的計算

按照下式計算大豆提取物中磷脂酰膽堿的含量：

式中：C?大豆提取物中磷脂酰膽堿的質量分數，%；

ρ——經過標準工作曲線計算得的提取物樣品溶液中磷脂酰膽堿的濃度，mg/mL；

V ——提取物樣品溶液的體積，mL；

M——提取物的質量，mg。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 流動相比例的確定

探究了流動相比例對磷脂酰膽堿保留時間的影響。如圖1所示，當流量為1.0 mL/min時，以乙腈∶水=85∶15（V/V）為流動相，磷脂酰膽堿的保留時間為 4.852 min；乙腈∶水=80∶20（V/V）為流動相，磷脂酰膽堿的保留時間為 4.410 min；乙腈∶水=75∶25（V/V）為流動相時，磷脂酰膽堿的保留時間為4.068 min。結果表明，降低乙腈的比例會使磷脂酰膽堿保留時間提前，但過低的乙腈比例會導致磷脂酰膽堿與其他物質分離不開，同時考慮到氨基柱的水相比例不宜太高，最終確定流動相比例為乙腈∶水=80∶20（V/V）。

圖1 不同流動相比例下磷脂酰膽堿的色譜圖

2.1.2 流速的選擇

考察了流速對磷脂酰膽堿保留時間的影響。如圖2所示，在流量為1 mL/min條件下，磷脂酰膽堿的保留時間為 4.410 min；流量為 0.8 mL/min 條件下，磷脂酰膽堿的保留時間為5.292 min。流速越大，磷脂酰膽堿出峰時間越早，考慮到分離效果與溶劑消耗，最終確定流量為0.8 mL/min。目前文獻報道的磷脂酰膽堿保留時間集中在9～40 min 之間[14, 16-17]，本實驗條件下磷脂酰膽堿的保留時間更短，檢測更加快速。

圖2 不同流速下磷脂酰膽堿的色譜圖

2.2 標準曲線的繪制與檢出限的確定

依次取上述不同濃度的磷脂酰膽堿系列標準工作液進樣進行檢測。以磷脂酰膽堿的質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3所示。結果表明，磷脂酰膽堿的濃度與峰面積在7.744～38.720 mg/L范圍內呈現較好的線性關系，線性回歸方程為y=49.587x+196.34，相關系數r2=0.9996。以3倍信噪比（S/N）作為檢出限確定標準，最終確定檢出限為1.54 mg/L。

圖3 磷脂酰膽堿標準曲線

2.3 精密度實驗

取同一磷脂酰膽堿標準樣品，按1.3.1中的條件連續進樣6次，分別測得峰面積并計算RSD值，檢測儀器的精密度。結果如表1所示，RSD為0.65%，表明儀器精密度良好，滿足實驗要求。

表1 精密度實驗結果

2.4 穩定性實驗

取同一樣品，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h 進樣，檢測并記錄峰面積，檢測樣品溶液的穩定性，結果如表2所示。RSD為0.79%，表明該樣品溶液在0～12 h 內較為穩定。

表2 穩定性實驗結果

2.5 加標回收實驗

采用外標法檢測回收率。選擇已知濃度的提取物樣品溶液，向其中加入一定量標準工作液，制成低、中、高三種濃度加標回收樣品。按50 μL進樣量進樣，平行測定3次，根據結果計算磷脂酰膽堿的回收率及其RSD值。結果如表3所示，在低、中、高三種濃度下加標回收率在98.37%～103.62%之間，平均加標回收率為100.39%，RSD為1.67%，表明該方法準確，滿足實驗要求。

表3 加標回收實驗結果

2.6 樣品檢測

按照1.3.4中的方法平行配置6份樣品溶液，以50 μL進樣量進樣，檢測峰面積并代入線性回歸方程中計算磷脂酰膽堿含量，結果如表4所示。結果表明，按本實驗方法提取的大豆粗提物中磷脂酰膽堿含量為16.31%。

表4 樣品檢測實驗結果

3 結束語

本實驗建立了一種基于氨基色譜柱，利用高效液相色譜檢測大豆提取物中磷脂酰膽堿的方法。經該方法檢測，無水乙醇提取的大豆提取物中磷脂酰膽堿的含量為16.31%。經過方法學驗證，該方法加標回收率在98.37%～103.62%之間，準確度較高，且具有較高的精密度和良好的穩定性。目前，大多數磷脂酰膽堿的高效液相色譜檢測方法的流動相采用三元體系，較為繁瑣，保留時間也較長。本實驗以乙腈-水二元體系作為流動相，操作簡單便捷；磷脂酰膽堿的保留時間在6 min內，縮短了磷脂酰膽堿的保留時間，檢測效率高。本實驗結果可豐富卵磷脂中磷脂酰膽堿的檢測方法，為磷脂酰膽堿的高效檢測提供參考。