利用多壁碳納米管的QuEChERS技術結合液相色譜-質譜法測定食用菌農藥殘留量*

薛科宇，田繼鋒，宋國華，魏 珂，金子純，趙婕妤，侯曉慧

（許昌市農產品質量安全檢測檢驗中心許昌市農產品質量安全檢測與風險評價重點實驗室，河南 許昌 461000）

食用菌營養豐富，富含蛋白質、礦物質、維生素、膳食纖維等營養成分和多糖類、核苷類等功能性成分，是集“天然、營養、保健”為一體的綠色食品，是人類飲食結構的重要組成部分。同時，因栽培成本低、投資小、市場好的特點，近幾年食用菌產業得到了快速發展。2020年全國食用菌總產量達4 043.87萬噸，總產值達3 127億元。在我國部分地區，食用菌產業已經成為優勢產業和脫貧產業，極大地促進了農村經濟發展，增加了農民收入[1-2]。

在食用菌栽培過程中，為有效抵制其競爭性雜菌、防治病蟲害、提高出菇產量及品質，會使用一定量的農藥。農藥的大量使用，雖然有效地防止了病蟲害，提高了經濟效益，但也給人類的身體健康以及生態環境帶來嚴重的威脅。并且，食用菌的基質來源比蔬菜復雜，因此建立快速、高效、靈敏的食用菌多農藥殘留檢測技術具有十分重要的意義。

目前，農藥殘留的分析方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜-質譜法等；樣品前處理技術主要有固相萃取法、凝膠滲透色譜法、加速溶劑萃取法等[3-7]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe） 是一種新穎、快速的分散固相萃取技術，具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、安全的特點，很多研究都是以該方法為基礎開展的。碳納米管因其獨特的微觀結構和較強的吸附能力，成為近年來研究的熱點。基于碳納米管的固相萃取技術具有操作簡單、快速、靈敏度高和重現性好等方面的特點，逐漸應用于食品安全檢測領域中[8-12]。

通過利用多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNTs） 的吸附性能，結合QuEChERS法，樣品經乙腈提取，液相色譜-質譜分析檢測，建立一種高效、快速、準確分析食用菌中多種農藥殘留的分析方法。結果表明，該方法操作簡單、分析準確高效，適用于食用菌的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農藥標準溶液（1 000 μg·mL-1），農業部環境保護科研監測所；QuEChERS提取鹽包（檸檬酸緩沖液體系鹽包，4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉），北京綠棉科技有限公司；QuEChERS凈化離心管（900 mg硫酸鎂），采購自上海安譜科技有限公司；多壁碳納米管（外徑20 nm～30 nm，長度 0.5 μm～ 2.0 μm，純度＞95%），南京先鋒納米材料科技有限公司；乙腈、甲醇、丙酮（色譜純），美國Fisher scientific公司；乙酸（分析純），美國Fisher Scientific公司；乙酸銨（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。試驗用水為超純水。

供試食用菌品種包括金針菇（Flammulina velutipes）、香菇 （Lentinus edodes）、平菇 （Pleurotus ostreatus）、蟹味菇 （Hypsizygus marmoreus），均購自許昌市當地超市。

1.2 儀器與設備

HS20500D型超聲波清洗器，天津市恒奧科技發展有限公司；ZG-YM1701型破壁機，寧波趙記電器有限公司；0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司；TTL-DCII型氮吹儀，北京同泰科技發展有限公司；EVOQ LC-TQ液相色譜質譜聯用儀，德國布魯克公司；ULPHW-IV超純水儀，四川優普超純科技有限公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 標準儲備液配制

分別準確移取每種標準溶液（1 000 μg·mL-1）0.8 mL于5 mL容量瓶中，用丙酮稀釋定容，配制成160.00 μg·mL-1的混合標準儲備液，轉移到棕色瓶中，-20℃保存。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取粉碎后的食用菌樣品10.00 g于離心管中，加10.00 mL乙腈，加入提取試劑包，迅速振蕩1 min；放入離心機以4 200 r·min-1離心5 min，取上清液6 mL于凈化管中；震蕩1 min后4 200 r·min-1離心5 min，取上清液4 mL于加有凈化劑的15 mL離心管中；40℃水浴氮吹近干，加入4 mL丙酮后超聲30 s；經0.22 μm微孔濾膜過濾后放入進樣小瓶，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acclaim TM RSLC 120 C18（柱長100 mm，直徑2.1 mm，粒徑2.2 μm）；柱溫：30℃；流動相A：水（10 mmol·L-1乙酸銨+0.01%乙酸）；流動相B：甲醇（10 mmol·L-1乙酸銨+0.01%乙酸）；梯度洗脫程序：0～3 min，11.0%～39.9%流動相B，流速 0.20 mL·min-1；3 min～14 min，39.9%～99.9%流動相 B，流速 0.40 mL·min-1；14 min～16 min，99.9%流動相 B，流速 0.40 mL·min-1～ 0.48 mL·min-1；16 min～20 min，99.9%流動相 B，流速 0.48 mL·min-1；20.1 min～23.0 min，沖洗，流動相B由99.9%逐漸減少至 1.0%，流速 0.48 mL·min-1；進樣體積 5 μL。

1.3.4 質譜條件

電離源模式：正離子模式。

掃描模式：多反應監測；離子源電壓3 500 V，霧化器電壓40 V；干燥氣流速20 L·min-1，干燥氣溫度350℃；鞘氣電壓40 V，鞘氣溫度400℃。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

理想的液相色譜流動相中有機相應具有粘度低、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。大部分液相分析試驗的流動相中有機相多選擇甲醇或乙腈[13]，因此設計分別以甲醇和乙腈作為有機相的試驗。同時，在液相色譜-質譜分析過程中，信號的強度會因為離子強度的變化而改變。在流動相中添加緩沖鹽，可有效地穩定體系，并提高信號響應強度。參照參考文獻[14-16]，試驗常用的添加劑為揮發性有機酸和低濃度的鹽，揮發酸濃度不超過0.1%，鹽濃度小于10 mmol·L-1[13]。因此設計分別以水-甲醇（均含有10 mmol·L-1乙酸銨）、水-乙腈（均含有10 mmol·L-1乙酸銨）作為流動相進行試驗，對常見農藥混標溶液進行質譜分析。結果顯示，在2種流動相中，常用農藥標準品均有響應；但在甲醇流動相中，農藥標準品的響應高于乙腈流動相。同時，試驗中還發現部分農藥標準品的峰型并不理想，少數出現前拖現象。為了優化峰型，在流動相中加入低濃度的乙酸（含量0.01%）進行試驗，結果見圖1。

圖1 目標化合物色譜圖Fig.1 Chromatogram of target compound

如圖1所示，流動相中加入低濃度的乙酸（含量0.01%） 使其峰型得到優化，圖1中目標化合物的濃度為0.10 mg·L-1。因此，選取水-甲醇（均含有10 mmol·L-1乙酸銨和0.01%乙酸） 作為色譜分析的流動相。

2.2 定性分析

用選定的流動相對目標化合物標準品溶液進行質譜分析。在正離子掃描下，調整碰撞電壓，確定目標化合物的定性離子對和定量離子對。各目標化合物峰型完整，各離子對符合定性分析要求[17]，具體結果見表1。

表1 目標化合物保留時間及質譜信息Tab.1 Retention time and MS Spectrometer results of target compound

2.3 線性關系與檢出限

將農藥混合標準溶液配制成一系列不同含量的標準溶液（0.01 ug·mL-1～0.40 ug·mL-1），在選定條件下進行測定，以樣品中各種目標化合物峰面積為縱坐標，質量濃度（ug·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，目標化合物在0.01 ug·mL-1～0.40 ug·mL-1質量濃度范圍內線性良好，相關系數r均大于0.99，定量限為0.01 ug·mL-1，可以滿足定量分析要求。

2.4 多壁碳納米管的選擇

為了能夠選擇到比較合適的碳納米管，選擇未檢出農藥殘留、基質干凈的平菇空白樣品，添加已知濃度（本次試驗濃度為0.10 mg·kg-1）農藥目標化合物，按照前處理方法進行試驗。以碳納米管作為試驗對象，設置5 mg、25 mg、50 mg的用量進行試驗。前處理后經LC-MS/MS檢測計算獲得各目標物加標回收率，結果見圖2。

圖2 碳納米管不同用量的目標物回收率Fig.2 Recovery of target compounds with different amounts of carbon nanotubes

由圖2可知，目標化合物的回收率與用量不呈現正相關關系。通常情況下，多農殘分析方法中各目標物的平均回收率應滿足的范圍是70%～120%，試驗結果顯示個別目標物的回收率不能滿足檢測要求，如乙酰甲胺磷、多菌靈、敵敵畏、亞胺硫磷、特丁硫磷、特丁硫磷亞砜、特丁硫磷砜、嘧霉胺、除蟲脲、治螟磷、咪鮮胺等化合物。這可能是因為碳納米管的用量大，吸附效果增強，造成某些農藥目標化合物的吸附，從而回收率降低。綜合以上因素，選擇5 mg的碳納米管用量進行后續試驗。

2.5 加標回收試驗

在粉碎后的金針菇、香菇、平菇空白樣品（未檢出農藥殘留、樣品基質干凈） 中分別加入0.03 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1混合農藥標準對照品，每個水平重復測定5次。按照樣品前處理方法，經液相色譜-質譜檢測，得到目標化合物的回收率范圍，結果見表2。

表2 目標化合物添加回收率及相對標準偏差（n=5）Tab.2 Spike recoveries and RSDs of target compounds(n=5)

如表2所示，目標化合物的加標回收率和相對標準偏差均符合檢測要求[18-19]。

2.6 樣品的測定

對市場上銷售的蟹味菇按照前處理方法進行測定，結果未檢出有農藥殘留物。

3 結論

食用菌中含有色素、蛋白質、氨基酸等物質，在檢測過程中會干擾目標化合物的響應。通過參考QuEChERS前處理技術，并對其進行改進，用碳納米管代替傳統QuEChERS方法中的PSA（乙二胺-N-丙基硅烷），利用碳納米管的強吸附性，提升凈化效果。對檢測條件、前處理條件進行了優化，常見的農藥殘留在香菇、平菇、金針菇等食用菌樣品中均得到了較好的回收率，滿足定性分析、定量分析的檢測要求。本方法操作簡單、結果準確、可行性強，能夠快速檢測食用菌中常見農藥殘留，可為食用菌中常用農藥殘留的風險檢測提供技術支持。