納米材料對水環境中微藻毒性的效應及機理研究進展

陳 燦，楊黎彬，周雪飛

(同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092)

納米材料是粒徑在1～100 nm的材料，主要包括金屬及金屬氧化物納米材料、碳納米材料以及量子點(quantum dots,QDs)[1]。目前，常見的納米材料包括Ag NPs(納米粒子)、碳納米管、TiO2NPs、ZnO NPs等[2-3]。納米材料具有大的比表面積、較好的導熱導電特性、良好的光學特性等優點[4-5]，在材料、信息、醫藥、能源等眾多領域得到廣泛應用[6-7]。納米材料在生產和使用過程中，不可避免會進入到水環境中，已經在眾多國家水環境中檢測到了納米材料，如表1所示。納米材料會吸附到微藻表面，被水生生物(如斑馬魚和水蚤)食入后會引起納米材料在生物鏈的富集，對不同類型的水生生物產生危害，最終可能進入人體，危害到肺、肝臟、腎臟、心臟、大腦、骨骼和軟組織[3,8-9]，對生態系統以及人體健康造成巨大威脅。因此，在納米材料大規模使用前，應考慮納米材料對水生生物的毒性并及時評估納米材料對水環境生態風險的潛在毒性[10-11]。

微藻是水環境生態系統中的初級生產者，是水生生態系統不可缺少的組成部分。先前采用海膽、魚類、螃蟹等水生生物檢測微塑料的毒性，但這些水生生物存在攝食微塑料的過程，不能很好觀察微塑料的作用，因此，微藻成為重點研究對象，微藻易培養、生長周期短、對環境變化敏感，常作為研究污染物影響的模型生物[12]。相關研究將微藻作為指示性生物，評估奧利克林、二甲基二十八烷基銨等個人護理產品對長三角地區地表水的環境風險，結果表明目標污染物的危險商數均大于1，將對長三角地區的魚類構成高風險危害[13]。Yang等[14]評估聚苯乙烯納米塑料對小球藻毒性的影響，研究發現在納米塑料的作用下抑制了小球藻生長和光合作用，其對生長作用抑制率達到27.73%，對光合作用的抑制率達到35.04%，為納米塑料對水生生物毒性的評估提供了依據。由于這一特性，微藻也常作為評價納米材料生態毒性的生物模型。近年來，國內外學者進行納米材料對微藻影響的研究[15]，微藻是水環境食物鏈中的初級生產者，納米材料對微藻產生的任何不利影響都會對整個水生食物網產生嚴重影響，因此，確定納米材料在微藻中的毒性作用以及毒性機制至關重要。本文在已有研究的基礎上，針對微藻生長、胞內組分、胞外多聚物、細胞結構綜述了納米材料對微藻的毒性效應，并在此基礎上歸納了納米材料對微藻的毒性機理，為今后開展納米材料對微藻毒害機制的深入研究提供依據。

表1 納米材料分布情況Tab.1 Distribution of Nanomaterials

1 納米材料對微藻的毒性效應

常用作毒性影響模型生物的微藻有小球藻、柵藻、魚腥腥藻、杜氏鹽藻、羊角月牙藻(Raphidocelissubcapitata)等。已有研究通常以微藻生物量定量描述納米材料對微藻的生長抑制，此外還表現在微藻胞內胞外組分的變化等方面。

1.1 微藻生長

大量研究表明，納米材料對微藻生長有抑制作用，會降低微藻的生長速率和生物量。納米材料毒性的大小取決于其尺寸、形狀、化學成分、電荷和氧化狀態、表面結構以及聚集狀態等[24]。Zhang等[25]研究在48 h后納米金剛石對小球藻生長的影響，發現在設定的質量濃度(5～50 mg/L)，納米金剛石顯著抑制了小球藻的生長，且隨著濃度的增大，抑制作用越大，5 mg/L時對小球藻的生長抑制率是33.1%；50 mg/L時抑制率高達75.4%。Chen等[26]研究Co NPs對肋骨條藻的毒性，發現Co NPs對微藻毒性隨著時間積累，在24 h時50 mg/L的Co NPs對肋骨條藻的生長抑制僅為23.9%，而在作用96 h后，抑制率達到73.6%。此外，研究中也常用半最大效應濃度(EC50)定量評價納米材料對微藻生長的毒性效應。Sendra等[27]在TiO2NPs對微藻的急性毒性效應試驗中得出，TiO2NPs對三角褐指藻、萊茵衣藻的EC50分別為552、132 mg/L。而Natalí等[28]的研究則表明Ag NPs對小球藻的EC50達到0.1 mg/L。納米材料對微藻的抑制作用的大小變化較大，取決于納米材料的種類。Kyung等[29]研究5種金屬氧化物納米材料對小球藻的生長抑制作用，發現其中ZnO NPs對微藻的生長抑制作用最大，Fe2O3NPs的抑制程度最小，EC50分別為2.0、76 mg/L，對微藻生長抑制毒性順序為ZnO NPs>NiO NPs>CuO NPs>TiO2NPs >Fe2O3NPs。表2總結不同類型的納米材料對常見微藻的生長抑制作用。不同種類的納米材料對同種微藻的抑制作用不同，同一種類的納米材料對不同種類的微藻也有較大區別，并且毒性作用隨著接觸時間的增強而加大。

表2 納米材料對微藻生長抑制作用Tab.2 Inhibition Effect of Nanomaterials on Microalgae Growth

1.2 微藻生化組分

微藻的生化組分為碳水化合物、蛋白質和油脂，試驗研究表明，在外界環境如pH、溫度、營養元素等作用壓力條件下，微藻生化組分會發生改變[28,35]。納米材料會促進微藻吸收營養物質，使得微藻在營養缺乏狀態下積累油脂。Zhang等[36]研究發現與對照組相比，存在QDs條件下(含量為10 mg/L)，脂質含量提高了20%。Kim等[37]研究MgAC NPs對小球藻脂質產率的影響，發現暴露于0.05 mg/L的MgAC NPs下，小球藻脂質生產率較對照組提高了25%。此外，Sarma等[38]發現在1 g/L的MgSO4NPs作用下，小球藻脂質顯著提升，較對照組提高了118.23%±5.67%。Ren等[39]研究不同納米材料對柵藻脂質積累的影響，試驗表明SiC NPs和g-C3N4NPs促使脂質分別提高了32.07%和28.83%，TiO2NPs和TiC NPs對脂質積累無顯著影響。因此，研究表明微藻細胞內脂質的積累與納米材料的種類和濃度有關。細胞內油脂累積時，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸的含量會增加，與極性膜脂質相關的長鏈多不飽和脂肪酸含量降低，從而阻礙微藻細胞生長[40]。碳水化合物是藻類資源化利用產物之一，同時可為藻類生長提供能量。碳水化合物含量增加是一種細胞應激反應現象，提高呼吸速率從而更好地供能[41-42]。Natalí等[28]研究Ag NPs對小球藻的影響，發現Ag NPs含量在360、720、1 440 μg/L下，小球藻碳水化合物含量分別提高了22%、29%、80%。Marchello等[41]發現小球藻胞內碳水化合物含量隨著TiO2NPs含量增加而升高，當TiO2NPs含量為7.9 mg/L時，碳水化合物含量提高了1.4倍。蛋白質是微藻重要的營養物質和滲透調節物質，對微藻生命活動起到了保護作用，也是在不利環境中重要的評價指標。Natalí等[28]研究了低濃度Ag NPs(含量<1.5 mg/L)對小球藻蛋白含量的影響，Ag NPs在含量為90～720 μg/L下，相較于對照組，蛋白質含量提升110%～293%；當Ag NPs含量為1 440 μg/L時，蛋白含量增加最多，達到了583%。而過高濃度的納米材料會導致活性氧(ROS)過量產生使微藻抗氧化酶系統受損，使得蛋白質含量降低。Pallavi等[43]研究發現在高質量濃度納米氧化鐵(50 mg/L)作用下，Coelastrellaterrestris的蛋白含量顯著下降。在納米材料作用下，微藻的蛋白質產量降低，并通過積累油脂、碳水化合物抵御納米材料的脅迫。由于納米材料具有體積小、比表面積大的特性，可以進入微藻細胞，影響微藻細胞分裂和轉錄機制，或者通過誘發氧化應激對DNA產生損傷。Kang等[44]通過代謝組學和轉錄組學研究氧化石墨烯量子點(GOQDs)對小球藻接觸和恢復的2個階段影響，在接觸GOQDs溶液后，用培養基繼續培養小球藻，檢測到在恢復階段氨酰-tRNA下調，表明對微藻造成的遺傳毒性是不可逆的。Schiavo等[45]發現SiO2NPs和TiO2NPs對杜氏鹽藻的遺傳毒性存在不同機制，前者是通過氧化應激產生ROS，繼而誘發DNA損傷，而后者直接與DNA作用，同時發生細胞分裂。也有相關研究表明氧化石墨烯抑制微藻細胞分裂，可能與其二氧化硅表面涂層有關[46]。

1.3 微藻胞外多聚物

微藻胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)是微藻分泌到胞外的復雜多樣的高分子聚合物，結構緊密多孔，主要由多糖、蛋白質、腐植酸等構成[47]。EPS不僅可以起到附著作用，而且可以協助微藻抵抗外界環境壓力，例如鹽脅迫、溫度異常、重金屬污染等，微藻分泌EPS是對惡劣環境的響應[48-49]。在納米材料作用下，微藻EPS分泌量會發生變化。Zhao等[50]研究納米CuO對小球藻EPS的影響，通過透射電鏡觀察到其EPS層增厚了近4倍。也有研究定量描述納米材料對微藻EPS產量的影響。據Sendra等[27]報道，暴露在TiO2NPs含量為10 mg/L下，萊茵衣藻的EPS產量為(23.0±1.2)×10-5mg/mL，相較于對照組，試驗組的EPS分泌量增加了2.15倍。EPS組成變化也常作為納米材料對微藻毒性效應研究。EPS中的高分子有機物會促進納米材料的絮凝，研究報道納米材料會促使微藻EPS中高分子量有機物轉化為低分子量有機物,從而減少微藻與納米材料相互接觸[51]。在納米材料作用下，EPS主要組分也會發生變化。Gao等[52]試驗結果表明：96 h暴露試驗后，TiO2NPs(含量為20 mg/L)小球藻EPS分泌量提高了26.3%，其中，多糖含量和蛋白質含量分別增加了12%和40.7%，而且多糖與蛋白質的比值顯著低于空白組，表明TiO2NPs會誘導微藻分泌更多的胞外蛋白。通過FTIR光譜發現微藻EPS含有豐富的官能團，如酰基、羥基等，富含這些絡合基團的胞外蛋白可以形成蛋白質電暈效應，從而更好地與納米材料結合[49,53]。就此推測EPS一方面通過靜電斥力維持納米材料在水環境中的穩定，另一方面通過化學鍵與納米材料結合，從而抑制納米材料細胞內化。因此，微藻會通過提高EPS分泌量特別是胞外蛋白含量，以減輕納米材料的毒性[54]。

2 納米材料對微藻的毒性機理

納米材料種類多樣，對微藻的毒性機理較為復雜。如圖1所示，目前提出的毒性機理可概括為遮蔽效應、機械損傷、氧化應激[53]。

圖1 納米材料對微藻的毒性機理[3,50,53]Fig.1 Toxicity Mechanism of Nanomaterials on Microalgae[3,50,53]

2.1 遮蔽效應

由于pH、天然有機質以及溶解鹽的作用，納米材料在水環境中難以穩定存在，容易團聚引起遮蔽效應。遮蔽效應是通過降低微藻的光捕獲率，影響其光合作用，對微藻生長產生影響[15]。納米材料會在微藻細胞表面發生團聚，引起遮蔽效應。Cheloni等[55]測量CuO NPs與萊茵衣藻混合液吸光度的變化，在納米氧化銅含量較低(8 μg/L、0.8 mg/L)時，OD750(750 nm 處吸光度)無明顯變化(空白組與2個試驗組分別為0.115、0.118、0.117)；當含量達到4 mg/L時，OD750升至0.148，表明微藻生長抑制與遮蔽效應之間存在相關性。Chen等[26]通過SEM發現Co NPs會在中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)表面聚集，試驗96 h后葉綠素含量降低了47.3%，表明納米材料通過影響微藻的光合作用抑制其生長。Nogueira等[56]研究也出現類似的現象，發現氧化石墨烯也會在培養基中聚集引起遮蔽效應，當氧化石墨烯含量達到100 μg/mL，Raphidocelissubcapitata的葉綠素熒光強度百分比下降，降至82%。然而也有研究認為納米材料的遮蔽效應不會顯著影響微藻的生長。如Melegari等[57]研究發現，在72 h的CuO NPs接觸試驗中，CuO NPs的遮蔽效應并不是抑制萊茵衣藻生長的重要致毒機理。遮蔽效應主要是納米材料由于自身表面化學性質發生團聚引起的，若增強納米材料在水中的穩定性，則可以一定程度上減輕遮蔽效應的毒性。Pasquini等[58]發現表面功能化的高純度碳納米管(SWCNT)在水中的分散度更高，與普通SWCNT相比，降低了對Escherichiacoli的生態毒性，證明了這一猜想。

2.2 機械損傷

納米材料尺寸微小，可以吸附于微藻細胞表面，甚至穿過細胞壁和細胞膜進入細胞內，對微藻細胞造成機械損傷。具體表現形式有細胞壁損傷、細胞膜損傷、改變細胞膜通透性、破壞細胞超微結構。納米材料內化是一個復雜的過程，會涉及與微藻細胞膜和細胞壁之間的作用。首先，納米材料接觸微藻的細胞壁，其鋒利的邊緣會對微藻的細胞壁造成物理損傷。Du等[59]研究發現氧化石墨烯會刺穿柵藻的細胞壁。隨后，納米材料可以通過內吞作用、載體蛋白或者離子通道通過細胞膜，破壞了細胞膜的雙層結構甚至引起膜穿孔[40,53]。Rai等[60]研究發現Ag NPs會吸附在微藻細胞表面改變細胞膜的通透性，增大細胞孔隙率，破壞細胞膜磷脂結構，擠壓質子泵。Sendra等[27]研究了TiO2NPs[(38±12)nm]和TiO2[(423±154)nm]對萊茵衣藻和三角褐指藻的影響，發現TiO2NPs對2種微藻造成的毒性更大，這是因為TiO2NPs可以與微藻細胞表面相互作用，對細胞膜產生損傷。通過細胞壁、細胞膜后，納米材料會進入微藻細胞內，破壞細胞內部結構，造成了細胞損傷[46,61]。Du等[59]研究了TiO2NPs對小球藻的毒性，發現TiO2NPs含量超過1 mg/L時，小球藻細胞出現了質壁分離的現象，且質壁分離程度隨著TiO2NPs含量的增加而增加，當含量增至10 mg/L時，觀察到小球藻細胞出現膜損傷；當含量達到20 mg/L時，出現細胞壁損傷以及內化現象，葉綠體結構被破壞，類囊體膜模糊。由此可見，納米材料由于其較為尖銳的邊緣，與微藻細胞相互作用后，不僅會造成細胞表面機械損傷，甚至會破壞細胞內部結構，上述過程為主要的毒性機制。

2.3 氧化應激

注：ASA為抗壞血酸；APX為抗壞血酸過氧化酶；DHA為脫氫抗壞血酸；GSH為谷胱甘肽；GR為谷胱甘肽還原酶；GSSG為氧化型谷胱甘肽；MDHA為單脫氫抗壞血酸；NADP+為煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸；NADPH為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；DHAR為脫氫抗壞血酸還原酶圖2 納米材料對微藻的氧化應激機理[62-65]Fig.2 Mechanism of Nanomaterials on Oxidative Stress of Microalgae[62-65]

3 納米材料與其他物質的復合毒性

自然環境中，微生物會受到多種污染物的影響。2種或多種污染物可能會產生協同作用或者拮抗作用，這主要取決于污染物的類型、濃度等因素。在生態系統中，NPs和其他可溶性物質之間可能存在復雜的相互作用，致使其毒性作用發生變化。納米材料具有抗菌作用，會與抗生素的作用機制產生交叉作用，這一特性可能會對抗生素的耐藥性產生影響。研究表明，在加入Ag NPs后，四環素的毒性增加了3.46倍[66]，與之相似，用斑馬魚研究聚山梨酯20與Au NPs的協同毒性，與單獨納米材料相比，斑馬魚對復合材料的攝取率及毒性增加[67]。

雖然人們廣泛研究游離金屬離子對各種生物的生理效應，但關于溶解離子和NPs對藻類生理過程的聯合效應的研究卻很少。納米材料的存在可能會改變金屬離子對微藻的毒性。研究表明在TiO2NPs存在下，Zn2+對魚腥藻的毒性增強[68]，氧化石墨烯會增加Cd2+的毒性[69]。然而TiO2NPs的存在會降低Cd2+的毒性[70]。同時，對多種納米材料共同作用的風險評估也必不可少。然而，在多種納米材料暴露中，每個NPs對微藻毒性貢獻較難區分。比如，與兩兩混合相比，TiO2NPs、SiO2NPs和ZrO2NPs三者的共同作用會對柵藻產生更強烈的氧化損傷，協同破壞線粒體膜功能，刺激脂質過氧化和抗氧化酶(SOD、CAT)的活性，而在相同濃度下，單個納米材料不會抑制柵藻的光合作用[71]。納米復合材料的主要毒性機制主要是納米復合材料通過增加納米空間位阻、穩定性，進一步加大與微藻的接觸，從而加強納米材料的毒性。這些研究現象表明納米材料會對復合毒性產生影響，許多學者研究報道納米材料的影響，但是對于復合污染物的相關研究還較少，因此，相關的機制需要進一步深入研究。

4 結語

納米材料作為一種新興污染物，已經受到廣泛的關注。雖然納米材料對微藻的毒性作用研究有一定的進展，但是納米材料對微藻的作用效果及生態風險尚未準確判定。本文結合現有的研究，探討納米材料對微藻的毒性作用并總結毒性機理，為今后深入探究納米材料對微藻的影響提供依據，這對于維持微藻生長以及水環境中的食物鏈穩定有著重要的作用。此外，基于目前的研究，在此對今后的工作進行展望。

(1)目前，納米材料與污染物對微藻的復合毒性研究較少，多數是單一毒性試驗，而實際情況中多是污染物協同對微藻產生毒性效應，因此，需要研究納米材料與其他污染物聯合對微藻的毒性效應，從而能更準確地評價在實際環境中納米材料對微藻的毒性效應。

(2)納米材料的劑量、尺寸、種類對不同種類的微藻影響相差較大。不少研究集中關注在納米材料對微藻的毒性抑制方面，目前不少研究表明低濃度的納米材料對微藻生長有促進作用，比如可以促進微藻生物質能源的積累，提高光合固碳效率，在微藻培養過程中投加納米材料促進微藻生長以及生化組分的積累是一種可行的方法。接下來的研究可圍繞納米材料對微藻的促進作用機制展開，更加全面了解納米材料對微藻的影響，利用納米材料促進有益微藻生長或抑制有害微藻生長，為今后研究拓展新的途徑。

(3)大多數研究關注的是納米材料對微藻的作用，而沒有關注微藻以及水環境因素對納米材料的影響。在水環境中，微藻與納米材料是相互作用的，今后可以研究微藻和環境因素對納米材料的影響，使微藻與納米材料相互作用機制更系統、全面。