不同海拔條件下烤煙成熟期根際土壤真菌群落結構及生態特征分析

高衛鍇 李茂森 李超 黃純楊 劉福童 馮煉 馮小芽 任天寶 李宙文

摘要：為探究不同海拔條件下植煙土壤真菌群落結構特征，以及驅動真菌群落的主要生態因子，選取3個不同海拔高度ZL（800 m）、ZS（1 000 m）、ZH（1 200 m）的烤煙成熟期根際土壤，采用18S rRNA高通量測序對土壤真菌進行分析。結果表明，中低海拔土壤pH值和速效養分含量顯著高于高海拔;中低海拔土壤真菌α多樣性顯著低于高海拔土壤;3個海拔條件下土壤優勢菌門為子囊菌門、擔子菌門和毛霉菌門等，其中，1 200? m海拔擔子菌門的豐度較800 m海拔提高了100.00%;1 000 m海拔捕蟲霉門的相對豐度相較于1 200 m海拔提高了238.26%;聚類熱圖分析結果表明，擔子菌門、Aphelidea與微生物量氮含量呈顯著或極顯著正相關，與速效鉀含量和土壤溫度呈顯著負相關;芽枝霉門與pH值呈顯著正相關，與微生物量碳氮比呈極顯著正相關;捕蟲霉門與堿解氮含量呈顯著負相關;FUNGuild分析結果表明，1 000 m海拔土壤腐生營養型真菌相對豐度最高，達30.79%;1 200 m海拔病理營養型真菌豐度最高，達4.45%?？緹煶墒炱诟H土壤真菌多樣性在不同海拔條件下表現出顯著差異，土壤溫度、速效鉀含量和微生物量氮含量是引起土壤真菌群落結構及多樣性變異的主要生態因子。

關鍵詞：植煙土壤;海拔;真菌群落;環境因子;營養類群

中圖分類號： S154;S572.061? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0221-07

海拔是烤煙種植區域類型選擇的重要影響因素之一[1-2]，海拔高度的變化常常會導致環境發生顯著變化，光、溫、水、土等資源也會隨之改變，影響土壤的發育和理化性質[3-4]。真菌是土壤微生物的重要組成部分，其多樣性和群落結構與土壤養分轉化[5]、土傳病害[6]與植物健康[7]有著直接的關系。研究真菌在土壤中的結構組成，驅動了土壤微環境的改良，物種多樣性的維持，以及對保持生態平衡具有重要意義[8-10]。貴州省遵義煙區是我國主要的烤煙種植區之一，海拔一般在800～1 300 m之間[11]，土壤微生物與氣候、植被類型及土壤性質等密切相關，而海拔變化往往在較短范圍內引起溫度、降水、植被類型和土壤性質等生物和非生物因子的顯著變化[12-15]。近年來，隨著測序技術的高速發展，不同海拔高度條件下土壤微生物變化規律已有大量的研究，且研究結果更加的多元化。李敏等對土壤真菌的研究發現，1 500 m與1 800 m的松根圍土壤真菌群落結構存在顯著差異，且土壤因子可以顯著影響真菌群落結構[16]。Murugan等對阿爾卑斯山的研究發現，高海拔土壤中的真菌數量高于低海拔土壤[17]。人類活動也會影響微生物的海拔分布狀況[18]。張倩研究發現，自然條件土壤與水稻土真菌群落組成存在顯著差異[19]。袁雅威研究發現湖南省張家界煙區土壤真菌數量隨著海拔的升高有降低的趨勢，高海拔地區植煙土壤的生物活性明顯降低[20]。

土壤微生物是生態系統過程中必不可少的參與者，控制著陸地生物圈中最大有機質庫的周轉[15]?；诟咄繙y序的微生物組學技術極大地推動了對土壤中未知微生物類群及功能的認識，尤其是根際微生物多樣性、菌落結構和功能，對植物營養元素吸收機制研究發揮了重要的作用[6]。烤煙成熟期是影響煙葉質量的關鍵時期，其中根際微生物群落結構是重要的影響因素之一。因此，研究不同海拔條件下真菌群落時空特征對煙株的生長發育和物質代謝具有重要的意義。本研究通過高通量測序技術結合FUNGuild數據庫分析貴州省遵義煙區不同海拔梯度上的土壤真菌群落結構和營養類群，通過研究真菌群落結構和營養類群受氣候、環境因子的調控機制，進一步明確對土壤微生物群落結構海拔格局的認識，有助于更好地預測和解析作物成熟期土壤微生物群落的功能屬性或多樣性，也為不同海拔梯度下植煙土壤微生態調控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

2020年在貴州省遵義市播州區下轄鴨溪鎮鴨溪基地單元進行取樣，該地區年平均氣溫14.6 ℃，無霜期280 d，年降水量為1 043.4 mm，年平均相對濕度為82%。地形以低山丘陵、崗前緩坡為主，海拔在800～1 200 m之間，土壤以水稻土、山地黃壤為主。主栽烤煙品種為云煙87，在4月中旬進行移栽。3個海拔處理的烤煙大田生育期基本相同。取樣地點共有3處，分別為鴨溪鎮江北咀（海拔 819 m，106°42′51″E，27°27′17″N）;樂山鎮新華村（海拔1 022.32 m，106°36′47″E，27°36′49″N）;樂山鎮新土村（海拔1 220 m，106°38′13″E，27°41′3″N）。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 供試土壤與樣品采集

2020年9月1日，在遵義市鴨溪基地單元沿著海拔高度，按200 m高度差進行采樣，共3個樣地，分別為海拔800 m（ZL）、1 000 m（ZS）、1 200 m（ZH）。根據5點取樣法確定取樣點，將取得的樣品混勻后，送往上海美吉生物公司，對采集的土壤樣品進行真菌多樣性檢測，剩余土壤風干后研磨，進行土壤基礎理化性質分析。

1.2.2 土壤理化性質檢測

參照《土壤農業化學分析方法》[21]分析土壤理化性質，對樣品做3次平行測定。采用三氯甲烷熏蒸-硫酸鉀浸提法測定微生物量碳氮（MBC、MBN）含量[22]。

1.2.3 土壤真菌多樣性檢測

土壤DNA提取和PCR擴增：使用 E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒（OMEGA公司）對土壤進行總DNA提取，利用NanoDrop 2000超微量分光光度計（賽默飛世爾科技公司）檢測DNA純度，檢測合格后用338F和806R引物對 V3～V4 可變區進行PCR擴增[9]。

IlluminaMiseq測序：使用瓊脂回收盒回收PCR產物，混合后送往IlluminaMiSeq平臺進行基因序列測定[9]。

1.3 數據分析及統計

采用Excel 2016分析數據，方差分析采用最小顯著性差異法用DPS 16.0軟件分析，熱圖分析根據物種豐度的相似性進行聚類，用R軟件的vegan包繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同海拔條件下植煙土壤理化指標

從表1可以看出，ZS處理土壤pH值和有機碳含量顯著高于其他2個處理;低海拔土壤（ZS、ZL）溫度顯著高于高海拔（ZH）;土壤堿解氮含量隨著海拔的升高表現為先降低后升高的趨勢，ZL、ZH處理之間無顯著差異;ZS處理土壤有效磷含量顯著低于ZL和ZH處理，分別降低32.62%和40.75%。土壤速效鉀含量隨著海拔的升高顯著降低，微生物量氮含量隨著海拔的升高而顯著升高，土壤微生物量碳含量隨著海拔的升高表現出先升高后降低的趨勢，均達到顯著差異，土壤微生物量碳氮比變化與其一致。

2.2 不同海拔條件下土壤真菌α多樣性

對9個土壤樣本進行檢測，共獲得519 700條有效序列，所有樣本平均OTU數為204個，3個海拔處理的共有OTU數為120個，高海拔處理OTU數量顯著高于低海拔處理（圖1）。

從表2可以看出，Simpson指數、Shannon指數、ACE指數和Chao指數均在ZL處理和ZH處理之間表現出顯著性差異，其中ZH處理的Shannon、ACE和Chao指數顯著大于ZS處理，而Simpson指數呈相反的表現。ZS處理Shannon指數顯著高于ZL處理，而ACE和Chao指數無顯著性差異。

2.3 土壤真菌群落結構分析

2.3.1 不同海拔條件下門水平真菌群落相對豐度? 研究結果表明，共獲得27 個門水平真菌菌群，將平均相對豐度<1%類群歸為其他，得到 8 個類群（圖2）。其中相對豐度較高的菌門分別為子囊菌門、擔子菌門、毛霉菌門、一種未分類的超類群和捕蟲霉門。

不同海拔高度門水平上土壤真菌豐度表現出差異（圖3），子囊菌門在3個海拔高度下表現出顯著差異性，其相對豐度以ZL處理最高，相較于ZS處理提高了7.41%;ZH處理擔子菌門豐度較ZL處理提高了100.00%;ZS處理的捕蟲霉門的相對豐度相較于ZH處理提高了238.26%。

2.3.2 不同海拔條件下土壤真菌β多樣性

從圖4-a可以看出，對樣本距離矩陣進行聚類分析，構建樣本層級聚類樹后高海拔地區樣本單獨聚在一起，中低海拔樣本具有一定的重疊，表明海拔條件在一定區域內改變了植煙土壤真菌群落結構。由圖4-b可以看出，PC1 軸和 PC2 軸的貢獻值分別為57.77%和24.18%。ZL處理樣本點距 ZS處理樣本點較近，說明ZL與ZS處理的土壤真菌群落結構具有一定的相似性，ZL處理與ZH處理的距離較遠，說明海拔條件顯著影響了真菌群落結構，且隨著海拔的高度差變大，影響也隨之變大。

2.4 土壤真菌群落與環境因子的相關性分析

從圖5可以看出，在門水平上相對豐度前20名的真菌門類與環境因子之間的相關關系。微生物量氮含量、pH值、溫度和速效鉀含量對不同海拔條件下真菌群落結構表現出顯著性影響。其中一種未分類的真核生物與溫度和速效鉀含量呈顯著或極顯著正相關，與微生物量氮含量呈極顯著負相關;擔子菌門則與溫度和速效鉀含量呈顯著負相關關系，與微生物量氮含量呈極顯著正相關;Aphelidea與速效鉀含量呈顯著負相關關系，與微生物量氮含量呈顯著正相關;芽枝霉門與pH值和微生物量碳氮比分別呈顯著或極顯著正相關，捕蟲霉門與堿解氮含量呈顯著負相關。

2.5 不同海拔條件下土壤真菌營養類型

從圖6可以看出，土壤中可鑒定真菌共存在6種營養類型。其中病理-腐生-共生過渡型豐度在全部樣本中占比最高，達到19.45%～47.50%。ZS處理腐生營養型真菌相對豐度最高，達到30.79%，較ZL、ZH處理海拔分別升高了186.77%、8.04%;ZH處理海拔病理營養型真菌豐度最高，達4.45%，相較于ZL、ZS處理分別升高了18.76%、56.61%。

3 討論與結論

真菌是土壤微生物的主要成員之一[23]，具有廣泛的生物多樣性。真菌具有高度的可塑性，并且能夠適應各種不利條件。不僅具備生產多種胞外酶的能力，也能夠分解各種有機物質、土壤成分，從而調節土壤碳氮的平衡[24-26]，同時，土壤真菌也是土壤主要病害來源，土壤中約70%的病害均來源于土壤真菌[27]。因此，改變土壤真菌多樣性在改善土壤質量和提高農業生態系統生產力的潛在應用方面是非常有前途的發展方向。海拔驅動微生物群落發生變化的規律及成因一直以來都是重要的研究方向，土壤真菌多樣性和群落結構隨海拔的變化呈現多種模式。本研究中，3個不同海拔高度的土壤真菌Simpson指數、Shannon指數、ACE指數和Chao指數均表現出顯著性差異，其中高海拔真菌Shannon指數、ACE指數和Chao指數均高于低海拔，Simpson指數低于低海拔。這與李敏等研究結果[16]一致，與盛玉鈺等在神農架的研究結果[28]相反，這可能是由于人類活動引起的真菌多樣性的變化。目前，眾多研究表明，海拔高度驅動了真菌群落結構及多樣性的變化，本試驗中，聚類樹圖和PCA分析均表明，高海拔土壤真菌群落結構與中低海拔之間存在著較大的差異。研究發現，子囊菌門和擔子菌門均為3個海拔高度下植煙土壤的優勢菌群，這與熊涵的研究結果[29]一致。研究表明，子囊菌門多數為腐生菌，主要作用是分解植物凋落物和降解土壤中的有機質，本試驗中子囊菌門之所以能占比最大，可能是因為其無性繁殖能力很強，能產生大量的分生孢子，增長迅速，使其在數量上占優勢。本研究發現，中海拔地區土壤腐生營養型真菌相對豐度較高，而高海拔地區土壤病理營養型真菌相對豐度較高，這可能是土壤真菌參與了土壤的有機質、動植物分解過程，真菌能夠分解纖維素、化合物以及參與土壤的氨化作用，對于植物來說是重要的氮素來源[29]。真菌群落組成與土壤有效養分具有親密的關系，土壤 pH 值作為影響植物群落組成的主要因素，可以通過改變植物群落結構調控真菌群落結構。土壤pH值和養分含量的變化規律被認為是土壤真菌群落的主要調節者。王媛媛等研究吉林省的玉米土壤發現，土壤真菌群落多樣性與pH值顯著相關[30]。本研究發現擔子菌門、Aphelidea與微生物量氮含量有顯著或極顯著正相關關系，與速效鉀含量呈顯著負相關關系;芽枝霉門與pH值表現出顯著的正相關關系，捕蟲霉門與堿解氮含量呈顯著負相關關系。孫海等研究發現，擔子菌門、子囊菌門等與土壤pH值、速效鉀含量、總氮含量、微生物量氮含量等有顯著關系[31]。董林林等對人參根際真菌群落的研究發現，pH值與座囊菌綱和Alatospora的豐度顯著相關，速效鉀含量與座囊菌綱、Alatospora、毛霉目的豐度顯著相關，土壤總氮含量與糞殼菌綱、毛霉目的豐度顯著相關[32]。

作為烤煙種植區域的重要影響因素之一，海拔高度對植煙土壤的理化性質及微生態環境有顯著影響。本研究發現，海拔升高引起了土壤速效鉀含量的降低，同時造成了土壤微生物量碳氮比的失衡，土壤病理營養型真菌相對豐度升高，這些因素可能給烤煙生長帶來不利的影響。生物炭作為一種土壤改良劑，在土壤微生態調控、固碳培肥等方面具有良好的效應。馮慧琳等研究發現，施加生物炭可以顯著提高土壤速效養分含量，提升土壤碳氮比，顯著降低致病菌的相對豐度，減少烤煙病害[9，33]。Tianvao等研究表明，通過施用生物炭改善土壤理化特性從而構建土壤真菌群落結構[34-35]。目前，這些研究大多在同一海拔梯度上進行，而關于施加生物炭對不同海拔梯度下植煙土壤理化性質和微生態環境的影響有待于進一步研究。

不同海拔梯度下植煙土壤真菌群落結構表現出一定的差異，高海拔真菌多樣性顯著高于低海拔;相關性分析結果表明，土壤溫度、速效鉀和微生物量氮含量是驅動真菌群落結構在海拔梯度上變化的主要驅動因子;海拔高度的變化引起了環境因子的變異，進而構建了不同的土壤真菌群落結構，本試驗為不同海拔梯度條件下土壤微生態調控提供了理論參考。

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