一株細(xì)菌素產(chǎn)生菌的分離鑒定及其所產(chǎn)新型細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)特性研究

＊?jiǎng)⒄?王金澤 黃一剛 任婷 金文剛 裴金金

（陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 陜西 723000）

食品行業(yè)非常需要能夠防止腐敗或致病細(xì)菌污染的試劑。然而，由于大多數(shù)消費(fèi)者擔(dān)心常用食品防腐劑的安全性，人們對(duì)天然和安全的防腐劑替代品的需求很高[1]。細(xì)菌素是一種對(duì)人體具有低口服毒性的低分子量多肽[2]，這些化合物作為生物防腐劑在食品工業(yè)中顯示出良好的應(yīng)用前景。根據(jù)Cotter，Hill，Ross[3]，細(xì)菌素分為兩大類(lèi)：I類(lèi)，以羊毛硫氨酸為基礎(chǔ)的細(xì)菌素；II類(lèi)，非羊毛硫氨酸細(xì)菌素。II類(lèi)細(xì)菌素分為4個(gè)亞類(lèi)：IIa類(lèi)、IIb類(lèi)、IIc類(lèi)和IId類(lèi)[7]。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量細(xì)菌素，但除了少數(shù)I類(lèi)和IIa類(lèi)細(xì)菌素的作用機(jī)制外，它們發(fā)揮抗菌作用的相應(yīng)機(jī)制尚不清楚。

康普茶作為中國(guó)南方的一種功能性飲料已有數(shù)千年的傳統(tǒng)，最近，它因其多種功能特性而受到歡迎。從康普茶中分離到的乳桿菌主要有球狀乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌，大多數(shù)研究都集中在康普茶的真菌區(qū)系上。在過(guò)去的幾年里，研究人員將重點(diǎn)放在從康普茶中分離出的功能性乳酸菌。在這項(xiàng)研究中，從中國(guó)漢中市的傳統(tǒng)康普茶中分離的植物乳桿菌#SLG10的無(wú)細(xì)胞上清液（CFS）中篩選并純化了一種名為植物乳桿菌#SLG10的新型細(xì)菌素。隨著證明該肽的分離，我們還闡明了其抗菌作用機(jī)制。

1.材料和方法

(1)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及鑒定

①乳酸菌的分離

康普茶購(gòu)自陜西省漢中市。將1g康普茶發(fā)酵劑壓碎并浸入10mL無(wú)菌蒸餾水中。瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)（MRS，Solarbio，北京，中國(guó)），37℃下培養(yǎng)48h。根據(jù)Liu等人[4]的方法獲得無(wú)細(xì)胞上清液（CFS）。使用瓊脂孔擴(kuò)散法定量CFS對(duì)金黃色葡萄球菌CICC10384和大腸桿菌CICC10302指示菌株的抗菌活性。如果在瓊脂孔周?chē)鷽](méi)有觀察到抑制區(qū)，則將抑制記錄為陰性。用抑菌活性（Log）和抑菌圈直徑構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。抗微生物活性表示為每毫升任意單位（AU），一個(gè)AU定義為顯示明顯生長(zhǎng)抑制區(qū)的最高稀釋度的倒數(shù)。

②細(xì)菌素產(chǎn)生菌菌株鑒定

用7F和1540R引物進(jìn)行16SrRNA基因序列分析，鑒定菌株的基因型（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT,3′-AGGAGG TGATCCAGCCGCA）[6]。用Ezup柱狀細(xì)菌基因組DNA純化試劑盒提取植物乳桿菌#SLG10的DNA。PCR產(chǎn)物用SanPrep柱DNA凝膠提取試劑盒純化。通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較來(lái)執(zhí)行序列的相似性搜索。

(2)細(xì)菌素的純化

①生物色譜制備

根據(jù)Tang等人使用的方法的稍微修改版本進(jìn)行生物色譜設(shè)置。用20%（v/v）鹽酸活化二氧化硅8h，然后用去離子水洗滌至中性，在120℃下干燥。2g蛋黃磷脂酰膽堿（EYPC）和1g 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-gly-蠟油磷脂酰甘油（鈉鹽）（DMPG）（2:1，w/w）溶于CHCl3/CH3OH（2:1，v/v），與20g 活性二氧化硅混合，并在恒溫（4℃）條件下混合120min，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，用N2吹掃干燥的殘余物并真空干燥過(guò)夜。脂質(zhì)膜包被的多孔硅膠在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中浸泡12h，在4℃下5000×g離心20min，然后用10mM、pH7.2的PBS緩沖液沖洗3次，作為250×4.6mm玻璃柱的填充物。

②細(xì)菌素的篩選純化

色譜柱用PBS（10mm，pH7.2，50mM NaCl）洗脫，植物乳桿菌#SLG10的CFS在25℃下以PBS為流動(dòng)相（0.5mL/min流速）洗脫，洗脫用分光光度法在215nm處監(jiān)測(cè)重復(fù)20次。蛋白質(zhì)含量用Bradford法測(cè)定。收集餾分并冷凍干燥，并篩選抗金黃色葡萄球菌CICC10384的抗菌活性，然后使用梯度洗脫對(duì)最有效的部分進(jìn)行反相高效液相色譜（RP-HPLC）（Symmetry C18柱，250×4.6mm，5μm，Waters，Dublin，Ireland）。將B相（100%乙腈）與A相（0.05%（v/v）三氟乙酸（TFA））混合40min，使B相（100%乙腈）的含量從5%增加到100%，從而改變流動(dòng)相的含量，A相的進(jìn)樣體積為1mL，流速為0.5mL/min，溫度保持在恒定水平（25℃）。

(3)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)表征

分離的植物乳桿菌#SLG10的一級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)N-氨基酸分析儀確定，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索。

(4)抗菌活性

細(xì)菌素對(duì)敏感細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）的程序[6]進(jìn)行測(cè)定。

CICC：中國(guó)工業(yè)菌種收藏中心；

MIC：能抑制指示菌株生長(zhǎng)的細(xì)菌素的最低濃度；

MBC：殺滅99.9%(下降三個(gè)數(shù)量級(jí)）的受試微生物所需的最低細(xì)菌素濃度。

2.結(jié)果與討論

(1)細(xì)菌素產(chǎn)生菌的分離鑒定

從康普茶中分離出的7株菌株是潛在的LAB活性菌株。其中，菌株SLG10是唯一能夠同時(shí)作用于革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌（金黃色葡萄球菌CICC10384和大腸桿菌CICC10302）的菌株。在排除了菌株SLG10抑菌效果與有機(jī)酸含量有關(guān)的可能性后，選擇菌株SLG10作為細(xì)菌素產(chǎn)生菌。基于菌株 SLG10 16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)推測(cè)菌株SLG10為植物乳桿菌。因此，我們將菌株SLG10命名為植物乳桿菌#SLG10。

過(guò)去幾年，研究人員對(duì)康普茶的真菌成分非常關(guān)注。同時(shí)，康普茶也可以被認(rèn)為是功能性乳酸菌的潛在豐富來(lái)源。如今，植物乳桿菌、益生菌菌株普遍被認(rèn)為是安全的[8]。植物乳桿菌#SLG10作為一種植物乳桿菌，不僅可以用作產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株，而且還具有作為發(fā)酵食品發(fā)酵劑的潛力。

(2)細(xì)菌素的純化

生物色譜洗脫如圖1A所示，僅獲得一種洗脫液，抗菌活性試驗(yàn)表明該洗脫液為細(xì)菌素部分，結(jié)果表明生物色譜法對(duì)細(xì)菌素的鑒定具有良好的特異性。合并洗脫液并使用反相高效液相色譜法進(jìn)一步分離，主峰如圖1B所示，保留時(shí)間為21.3min。

圖1 細(xì)菌素SLG10的純化

在本研究中，生物色譜法能夠從植物乳桿菌#SLG10的無(wú)細(xì)胞上清液（CFS）中快速篩選和分離細(xì)菌素。

(3)植物乳桿菌#SLG10的結(jié)構(gòu)特性

質(zhì)譜分析顯示，一個(gè)與質(zhì)量為1422Da的物種有關(guān)的特征峰。該化合物的一級(jí)結(jié)構(gòu)為十肽，序列為ASN-IleVal-Trp-Gln-Leu-Ile-Gly-Leu-Pro-Ala-Gln-Ala（NIVWQLIGLPAQA）。BLAST分析表明，該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的細(xì)菌素序列不同，因此分離出的多肽是一種新的細(xì)菌素，命名為植物乳桿菌#SLG10。植物乳桿菌#SLG10屬于Ⅱ類(lèi)細(xì)菌素，因?yàn)樗缓蛎虬彼峄験GNGVXC。

CD譜表明植物乳桿菌#SLG10呈現(xiàn)不規(guī)則的螺旋結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)的植物乳桿菌#SLG10的三個(gè)結(jié)構(gòu)分區(qū)表明它呈現(xiàn)不規(guī)則的線性形成。植物乳桿菌#SLG10的理論質(zhì)量是1422.26Da，這與MS測(cè)試的結(jié)果一致。

在結(jié)構(gòu)上，植物乳桿菌#SLG10類(lèi)似于其他具有無(wú)規(guī)卷曲但具有明確構(gòu)象的小而疏水的細(xì)菌素，這些結(jié)構(gòu)特征可能會(huì)增加細(xì)菌素在復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性。

(4)植物乳桿菌#SLG10的穩(wěn)定性

在本研究中，植物乳桿菌#SLG10在加熱處理后仍保持其抗菌活性，在37℃儲(chǔ)存14天，甚至在4℃儲(chǔ)存2個(gè)月后仍保持其抑制活性（圖2B）。植物乳桿菌#SLG10在pH2.0-7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，但在pH8.0及以上時(shí)活性下降（圖2C）。這些結(jié)果表明植物乳桿菌#SLG10在食品加工過(guò)程中將保持顯著的穩(wěn)定性。有趣的是，植物乳桿菌#SLG10對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感（圖2A），缺乏敏感性可能歸因于肽的小尺寸。

圖2 酶、溫度和pH對(duì)細(xì)菌素SLG10的影響

A：T1-脂肪酶；T2-a-淀粉酶；T3-蛋白酶K；T4-木瓜蛋白酶；T5-a-胰凝乳蛋白酶；T6-胰蛋白酶；T7-胃蛋白酶；T8-過(guò)氧化氫酶；B：T1-60℃；T2-80℃；T3-100℃；T4-37℃持續(xù)14天；T5-4℃持續(xù)兩個(gè)月；C：T1-pH2；T2-pH3；T3-pH4；T4-pH5；T5-pH6；T6-pH7；T7-pH8；T8-pH9；T9-pH10。三個(gè)重復(fù)相同，因此沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(5)抗菌活性

植物乳桿菌#SLG10的抗菌活性如表1所示，植物乳桿菌#SLG10對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，重要的是，植物乳桿菌#SLG10對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也有活性。這種活性可能是因?yàn)榧?xì)菌素的作用方式與抗生素不同。值得注意的是，植物乳桿菌#SLG10也對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌有活性，根據(jù)敏感細(xì)菌的不同，植物乳桿菌#SLG10的MIC值為16～32μg/mL（表1）。

表1 細(xì)菌素SLG10的抗菌活性

3.結(jié)論

綜上所述，SLG10菌株經(jīng)鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum），是從我國(guó)南方傳統(tǒng)的康普茶中分離到的。采用生物層析和反相高效液相色譜（RP-HPLC）聯(lián)用的方法，從SLG10菌株的CFS中分離純化植物乳桿菌#SLG10。這種新的Ⅱ類(lèi)細(xì)菌素對(duì)G+和G-細(xì)菌均有抗菌活性。本文發(fā)現(xiàn)的新型細(xì)菌素是一種很有前途的抗菌劑，在食品保鮮或制藥工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用前景。