直接抗病毒藥物治療丙型肝炎失敗的影響因素分析

楊宇晴， 尚 佳， 盧誠震， 楊 松， 陳宏宇， 潘家莉， 韓一凡， 席宏麗， 亢 倩， 譚 寧， 徐小元

北京大學第一醫(yī)院 感染疾病科， 北京 100034

HCV感染是慢性肝病最常見的病因之一，可能導致肝衰竭、肝硬化和肝癌，是重大的全球公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2015年全球有7100萬人有慢性HCV感染，39.9萬人死于HCV感染引起的肝硬化或肝細胞癌。以往的標準治療是聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林(RBV)(PR方案)，隨著直接作用抗病毒藥物(direct antiviral agents, DAA)的上市，傳統(tǒng)的PR方案逐漸被DAA取代。目前， DAA是治療HCV感染的推薦藥物，其在已知主要基因型和主要基因亞型的 HCV 感染者中都能達到 90% 以上的持續(xù)病毒學應答(sustained virological response, SVR)[1]。然而，還有少量HCV感染者出現(xiàn)DAA治療失敗，包括病毒學突破和復發(fā)。本研究選取的DAA治療失敗患者主要是治療結束時血液中檢測不到 HCV RNA，但在治療結束后HCV RNA復陽患者，從基線臨床資料和基因測序尋找耐藥相關替代突變(resistance-associated substitution, RAS)兩個方面與治療成功的HCV感染者進行比較，旨在分析DAA治療丙型肝炎失敗的影響因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2019年11月—2021年10月來自多個中心的慢性丙型肝炎(CHC)DAA初治失敗的患者13例為治療失敗組，所有患者均為經(jīng)過12周完整療程DAA治療，治療結束時HCV RNA陰性，但治療結束后HCV RNA轉為陽性的患者。患者開始治療時間從2017年11月到2021年7月不等，血清HCV RNA復陽時間從2018年3月到2022年1月不等。選取2017年12月—2020年5月在北京大學第一醫(yī)院感染疾病科門診就診的 51例DAA治療成功的CHC患者作為對照組，均為初治患者[2]。所有患者的CHC診斷均符合我國《丙型肝炎防治指南(2019年版)》[1]。排除標準：(1)臨床資料大量缺失的患者；(2)未收集治療后HCV RNA陽性血清樣本，或血清樣本出現(xiàn)明顯溶血或污染的患者；(3)合并其他病毒感染者，如HBV、HIV等。

1.2 觀察指標 收集患者全部的臨床資料，包括患者性別、年齡、治療前的基因分型(采用PCR測序法)、治療失敗使用的藥物及療程、治療失敗時的采血日期、血清HCV RNA定量、一些常見血液及生化指標等，將治療失敗和治療成功的患者基線資料進行對比和統(tǒng)計學分析。收集治療失敗患者HCV RNA復陽血清樣本和治療成功患者基線血清樣本進行HCV RNA提取、逆轉錄、PCR擴增NS3/NS5A/NS5B三個片段，然后進行Sanger測序，獲得峰圖。

1.3 實驗設計 根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit(德國，Qiagen公司)試劑盒的說明書進行患者血清病毒RNA的提取。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國，ThermoFisher公司)進行RNA的逆轉錄PCR，所有操作均使用一次性耗材，并在冰上進行。參照既往文獻設計引物，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，將逆轉錄后得到的cDNA進行巢式PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。陽性擴增產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger測序，以AJ238799.1作為參考序列，用Vector NTI Suite 9.0軟件對序列信息進行比對分析，并提交HCV耐藥數(shù)據(jù)庫(http://hcv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php)進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的計量資料以M(P25～P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，進行單因素和多因素logistic回歸分析計算比值比(OR)并分析治療失敗的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 治療失敗組一般資料 DAA治療失敗組共納入13例患者，13例患者中僅1例患者合并慢性腎臟病(CKD)3期，其他患者均無合并疾病。13例患者中有12例有完整療程資料，全部于用藥結束后1年內復發(fā)，其中3例于1個月內復發(fā)，2例于2個月內復發(fā)，2例于3個月內復發(fā)，2例于6個月內3個月后復發(fā)，3例于12個月內6個月后復發(fā)。5例男性患者中有4例于3個月內復發(fā)，1例于3個月后復發(fā)，7例女性患者中有3例于3個月內復發(fā)，4例于3個月后復發(fā)， HCV RNA是否在3個月內復陽與患者性別無關(P=0.198)。收集到基因型數(shù)據(jù)的患者共12例，其中5例為1b型，3例為2a型，4例為3b型。3b型患者均為丙通沙(索磷布韋維帕他韋片，SOF/VEL)治療失敗，2a型患者中1例為丙通沙治療失敗，2例為丙通沙合并利巴韋林(RBV)治療失敗。1b型患者中，丙通沙、擇必達(艾爾巴韋格拉瑞韋片，EBR/GZR)、仿制藥(化學名稱未知)治療失敗均為1例，2例為百立澤/速維普方案[鹽酸達拉他韋(DAC)片聯(lián)合阿舒瑞韋(ASV)軟膠囊]。3b或2a型患者治療失敗可能與應用丙通沙密切相關，而1b型治療失敗患者則存在多種用藥方案可能。此外，經(jīng)過統(tǒng)計分析，男性治療失敗患者的基線TBil、DBil、Cr普遍高于女性(P值均<0.05)(表1)。

表1 治療失敗患者性別與部分生化指標的關系

2.2 兩組患者間的臨床資料對比 將治療失敗組和對照組丙型肝炎患者基線臨床資料進行對比(表2)，兩組之間年齡、基因型差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。將它們納入logistic回歸模型(表3)顯示，年齡55歲及以下、基因型為3b型患者DAA初治失敗的風險增加(P值均<0.05)。

表2 治療失敗組與對照組患者基線特征對比

表3 基線logistic回歸分析DAA初治失敗的獨立影響因素

2.3 治療失敗患者的基因測序結果及對比 分別獲得NS3、NS5A及NS5B區(qū)基因序列各3、5、5例，各RAS分布情況見表4。5例擴增得到目的基因片段的患者中4例為1b型，可能是由于設計引物的參考序列AJ238799.1為基因1b型HCV全長基因組序列[3]。3例NS3基因片段共有的RAS是A66G和F147S，5例NS5A基因片段共有的RAS是Q24/K26/L34V，5例NS5B基因片段共有的RAS是Q47L/R98K/Q127L/A218S，均不是3種基因片段上的常見RAS。

表4 治療失敗組RAS分布情況

2.4 兩組患者耐藥情況對比 根據(jù)既往研究[4]，NS3基因片段上的RAS主要為Y56F、Q80K、S122G、V170I；NS5A基因片段上的RAS主要為R30Q、P32A、P58S、Y93H；NS5B基因片段上的RAS主要為C316N、C451H及I585C。51例治療成功患者共獲取NS3、NS5A、NS5B區(qū)基因序列各39、38、38例。其主要的RAS發(fā)生率與5例治療失敗患者的對比見圖1。由圖可知，治療成功患者NS3區(qū)最常見的RAS是S122G，發(fā)生率為71.79%，其次是V170I，發(fā)生率為38.46%；NS5A區(qū)最常見的RAS是Y93H，發(fā)生率為21.05%，其次是R30Q，發(fā)生率為10.53%；NS5B區(qū)的RAS主要是C316N，發(fā)生率為71.05%。3例治療失敗患者NS3基因片段中1例檢測到S122G，2例檢測到V170I，而Q80K和Y56F均未檢測到，3例共有的A66G和F147S在51例治療成功患者中未出現(xiàn)；5例治療失敗患者NS5A基因片段中4例檢測到Y93H，3例檢測到R30Q，而P32A和P58S均未檢測到，5例共有的Q24/K26/L34V在51例治療成功患者中未出現(xiàn)；5例治療失敗患者NS5B基因片段中C316N、C451H和I585C均未檢測到，5例共有的Q47L/R98K/Q127L/A218S在51例治療成功患者中未出現(xiàn)。

圖1 RAS的發(fā)生率對比

3 討論

根據(jù)既往文獻資料[5]，與DAA治療失敗相關的因素包括用藥方案和療程的選擇、耐藥情況(主要是NS5A RAS)、基因型、疾病進展(如肝纖維化)等。本研究結果顯示，DAA治療失敗導致的HCV RNA復陽一般出現(xiàn)在治療結束后1年之內，男性患者的基線TBil、DBil、Cr普遍高于女性，可能提示肝臟疾病進展情況，包括肝纖維化、肝硬化或肝臟腫瘤可能加速DAA治療失敗的發(fā)生。4例3b型患者均為丙通沙治療失敗。丙通沙是我國最為常用的泛基因型DAA，參考2019年版《丙型肝炎防治指南》[1]，以我國人群為主的亞洲臨床試驗結果顯示，丙通沙治療 12 周，在基因 1a 型、1b 型、2 型、3a型、3b 型和 6型的 SVR12 率分別為 100%、100%、100%、95%、76%和99%，即丙通沙針對3b型患者的SVR12率明顯下降。基因1b型患者由于可應用的治療方案較多，不同方案均可能導致治療失敗，HCV RNA復陽。

將治療失敗與治療成功兩類人群進行對比， 進一步說明年齡和基因型與DAA的治療成功率密切相關，3b型患者由于治療方案選擇不當、自身疾病進展等多種原因更易出現(xiàn)治療失敗的情況。丙通沙在以我國人群為主的亞洲臨床試驗結果顯示，丙通沙對于基因3b型患者的SVR12率為76%，而肝硬化患者的SVR12率僅為50%，遠低于整體的SVR率[6]。本研究還發(fā)現(xiàn)患者年齡也可能是DAA治療失敗相關的危險因素，年齡在55歲以下的人群治療失敗的風險更高，此結論需擴大樣本量后進一步得到驗證。

既往研究[7]表明，RAS 的發(fā)生和類型取決于病毒的基因型和藥物。與其他基因型相比，RAS在基因型1a和3型中更常見[8]。它可能因暴露于DAA治療而出現(xiàn)，也可能存在于未接受DAA治療的患者中。本研究中治療失敗與成功的RAS有明顯的區(qū)別，可能是不同的DAA與病毒核酸之間的相互作用，使RAS發(fā)生了變化。

擇必達的有效成分包括艾爾巴韋和格拉瑞韋。艾爾巴韋治療失敗最常見的RAS是GT1b中的Y93H和L31F/M/V，其中L31M+Y93H可顯著降低艾爾巴韋對于GT1b患者的療效(降低5000倍)。與格拉瑞韋治療失敗有關的常見NS3 RAS是V36L/M、Y56F/H、Q80K/L、R155I/K/L/S、A156G/M/T/V、V158A和D168A/C/E/G/K/N/V/Y，主要存在于GT1a型中，也可存在于GT1b型中[9]。丙通沙的有效成分是索磷布韋和維帕他韋。RAS S282T與索磷布韋治療失敗有關，但在含索磷布韋方案治療失敗患者中很少發(fā)現(xiàn)(<4%)，可能是因為它的適應性較低，可檢測到的時間段較短。有研究[10]表明L159F(+C316N/L320F)可能影響GT1和GT3型患者索磷布韋治療失敗，其中L159F+C316N主要在GT1b型患者中檢測到，而L159F+V321A僅在GT1a和GT3型患者中檢測到。與維帕他韋治療失敗相關的NS5A RAS涉及位置24、28、30、31、32、58、92和93，最常檢測到的RAS是Q30E/H/K/L/R、M28T/V， GT1b中的Y93C/H/N/S/T和L31M/V，GT2中的L31I/M/V和Y93H，GT3中的A30K/V、E92K、Y93H/N/R和L31M/P/V，天然NS5A RAS可導致GT3患者SVR12率降低，其中基線時有Y93H的患者SVR率更低[11]。與達拉他韋治療失敗有關的RAS包括GT1b中的Y93C/H/I/R和L31F/M/V，GT3中的L31I、Y93H和A30K。Y93H也是達拉他韋治療失敗的常見RAS，且在各種基因型中都可以檢測到[12]。

本研究中擇必達治療失敗患者存在L31F+Y93H降低艾爾巴韋療效，但也檢測到其他RAS如NS3的V48I/151A/170I、A66G/150V、F147S等。丙通沙聯(lián)合利巴韋林治療失敗患者未檢測出影響索磷布韋的常見RAS，檢測到影響維帕他韋的常見RAS包括Q24和R30Q，但也檢測到其他RAS如L34V/37F/199V、V138L/153L/164P/174T/196T等。2例達拉他韋聯(lián)合阿舒瑞韋治療失敗患者分別檢測出影響達拉他韋的L31V+Y93H和L31M+Y93H，但也檢測到其他RAS如Q24、K26、L34V、T83M、H85C/S、V164A/174T、K166R等。目前已知的針對不同DAA的RAS中，本研究檢測出了部分，如針對維帕他韋和艾爾巴韋的31M/93H，針對達拉他韋的30Q/31M/93H等[10,13-15]，而其他檢測出的RAS對于DAA有哪些影響，需要后續(xù)進一步深入探索。

綜上，DAA治療失敗一般出現(xiàn)在治療結束后1年之內，男性患者可能伴隨更嚴重的肝臟疾病進展。年齡在55歲以下和基因3b型患者治療失敗風險更高。由于藥物可能改變突變位點，突變位點也可能影響藥物療效，治療成功人群的治療前常見RAS和治療失敗后人群的有明顯區(qū)別，對后續(xù)治療方案的制定提供了思路。本研究存在一定的局限性，納入的總樣本數(shù)量較少，治療失敗的患者相對有限，僅有5例治療失敗患者測定出RAS，且沒有3b型治療失敗患者的血清成功檢測出RAS，使3b型患者治療失敗原因的討論無法在基因水平展開。上述統(tǒng)計學推論是否正確，以及RAS與DAA的相互作用對于臨床決策的幫助，還等待進一步的探索發(fā)現(xiàn)。

倫理學聲明：本研究方案于2017年9月13日經(jīng)由北京大學第一醫(yī)院生物醫(yī)學研究倫理委員會審批，批號: (2017)科研第(02)號。血清樣本的采集和臨床資料的收集均獲得患者知情同意。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：楊宇晴負責課題設計，樣本收集，資料分析，撰寫論文；尚佳、盧誠震、楊松參與樣本收集；陳宏宇參與資料分析；潘家莉、韓一凡、席宏麗參與樣本處理；亢倩、譚寧參與論文修改；徐小元負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。