去脂軟肝方對非酒精性脂肪性肝炎大鼠FXR-FGF19通路的影響

夏恩蕊， 田格格， 張素妍， 張順貞

云南中醫藥大學 中藥學院， 昆明 650000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中的炎癥亞型，隨著肥胖及其他代謝疾病的發病率增加，NASH的患病人數也逐步攀升[1]。已有研究[2]表明，對法尼醇X受體(FXR)進行調節，可使NASH得到不同程度的改善。在FXR-成纖維細胞因子19(FGF19)通路中，腸道FXR激活上調FGF19，FGF19隨門靜脈循環系統與肝細胞FGF受體4(FGFR4)結合，進而抑制膽汁酸合成酶CYP7A1，降低膽汁酸表達[3-4]，減少機體對脂質的吸收。去脂軟肝方在臨床治療NASH方面取得了較好療效[5]，本實驗旨在探討去脂軟肝方對NASH大鼠FXR-FGF19通路的影響，為臨床治療NASH提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 雄性SD大鼠(180～220 g)44只購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號: SCXK(湘)2019-0004，實驗單位使用許可證號: SYXK(滇)K2013-0002。去脂軟肝方(蘭花參、莪術、白術、山楂、菊花、三七、青皮)；辛伐他汀片(Merck Sharp & Dohme BV，RO13440)。高脂飼料(82.5%普通飼料、10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉)[6]。普通飼料購自楚商生物有限公司。IL-18、IL-1β、FGF19、膽汁酸(BA)試劑盒(江蘇酶免，MM-20263R1)。FXR抗體(Affinity，DF12511)、CYP7A1抗體(Affinity，DF2612)。顯微鏡(德國ZEISS)、HE染色套裝(Phygene，20200706)、飽和油紅O(索萊寶，20200824)。ltrapure RNA Kit RNA提取試劑盒(康為世紀，CW0581S)；HiFiScript cDNA Synthesis Kit(康為世紀，CW2569M)；UltraSYBR Mixture(康為世紀，CW0957M)。垂直板電泳裝置(TanonVE-180P RE)、垂直板電泳膠轉膜儀裝置(Tanon VE-586)、熒光定量PCR儀(Heal Force，CG)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥 44只雄性SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組(Control組，n=8)、模型組(HFD組，n=12)、辛伐他汀組(Simvastatin組，n=8)、去脂軟肝方高劑量組(QH組，n=8)、去脂軟肝方低劑量組(QL組，n=8)，Control組給與普通飼料喂養，其余組高脂飼料喂養。HFD組分別于4周末、8周末取2只大鼠驗模，其余10周末取材。Control組、HFD組以生理鹽水(2 mL/d)灌胃，Simvastatin組以辛伐他汀灌胃(給藥劑量為1.8 mg/kg)；QH組、QL組以去脂軟肝方藥液按生藥量灌胃，給藥劑量分別為27.72 g·kg-1·d-1、13.86 g·kg-1·d-1。

1.2.2 樣本處理 10周末收集大鼠肝臟、血清、小腸。肝大葉用4%多聚甲醛固定常溫保存，其余肝組織分裝5份于2 mL離心管中。小腸取10 cm于4%多聚甲醛中固定，其余分裝5份于2 mL離心管中。所有樣品(4%多聚甲醛固定除外)保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 生化指標檢測 采用全自動血清生化儀，檢測大鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C。

1.2.4 病理切片HE染色、油紅O染色 取4%多聚甲醛固定后的10周大鼠肝臟，常規制備肝組織石蠟切片，進行HE染色，鏡檢。取相同周次樣本，常規操作制備冰凍切片，油紅O染色后封片，鏡檢。使用Image-Pro Plus 6.0軟件統計油紅O切片橘紅色陽性區域累計光密度(IOD)與所選區域總面積(Area)，計算陽性率(IOD/Area)。

1.2.5 ELISA試劑盒檢測 根據試劑盒說明書，檢測8周大鼠肝臟、小腸中FGF19，以及肝臟中BA。

1.2.6 qRT-PCR 按試劑盒步驟提取RNA，測定濃度和純度。利用Primer 3軟件設計引物序列，由華大基因合成，以RT-PCR方法檢測小腸中FXR mRNA、肝臟中CYP7A1 mRNA。通過2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.7 免疫組化法 肝臟切片進行常規脫蠟復水、抗原修復、過氧化物酶結合、抗原封閉。滴加一抗4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫30 min，PBS沖洗；滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗。DAB顯色5 min，PBS沖洗，蘇木精復染5 min，鹽酸酒精分化1～3 s，自來水沖洗10 min，常規脫水，透明，封片，鏡檢。觀察大鼠小腸中FXR、肝臟中CYP7A1表達情況。免疫組化結果使用Image-Pro Plus 6.0軟件統計棕色陽性區域累計光密度(IOD)與所選區域總面積(Area)，計算陽性率(IOD/Area)。

2 結果

2.1 肝臟病理變化 Control組大鼠肝細胞形態規則且排列有序，細胞核邊緣清晰；HFD組肝細胞呈現大量脂肪空泡及氣球樣變，細胞排列紊亂，伴隨肝細胞水腫和炎性滲出。與HFD組相比，各用藥組脂肪變性情況改善，脂肪空泡減少，無明顯炎性滲出，細胞形態較規則，肝索較為清晰。

Control組肝組織油紅O染色切片細胞核清晰，大部分為藍紫色，少見脂滴；HFD組出現大面積橘紅色脂滴，數量較多，細胞形態不規則，呈現明顯脂肪變性。與HFD組相比，各用藥組橘紅色脂滴陽性率均減少，其中QH組效果較為明顯(圖1、表1)。

表1 大鼠肝臟油紅O切片陽性率比較

圖1 肝臟病理切片(×400)

2.2 血脂和肝功能指標變化 與Control組相比，HFD組大鼠HDL-C顯著下降，ALT、AST、TC、TG、LDL-C均顯著上升(P值均<0.05)。與HFD組相比，各用藥組的HDL-C顯著升高，ALT、AST、TC、TG、LDL-C均顯著下降(P值均<0.05)(表2)。

表2 大鼠血脂、血清肝功能指標比較

2.3 FXR-FGF19通路相關指標變化

2.3.1 ELISA檢測結果 與Control組相比，HFD組大鼠小腸FGF19顯著下降(P<0.05)、肝臟BA顯著升高(P<0.05)。與HFD組相比，各用藥組的小腸中FGF19顯著升高(P值均<0.05)，肝臟BA顯著下降(P<0.05)。HFD組大鼠與Control組相比肝臟FGF19有下降趨勢，各用藥組與HFD組相比肝臟FGF19有升高趨勢，其中Simvastatin組呈現顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 大鼠肝臟、小腸中FGF19和肝臟中BA水平比較

2.3.2 qRT-PCR檢測結果 與Control組相比，HFD組大鼠FXR mRNA顯著下降(P<0.05)，CYP7A1 mRNA顯著升高(P<0.05)。與HFD組相比，QH組FXR mRNA顯著升高(P<0.05)，QL組顯著降低(P<0.05)，QH組CYP7A1 mRNA顯著下降(P<0.05)(表4)。

表4 大鼠小腸FXR mRNA、肝臟CYP7A1 mRNA相對表達量比較

2.3.3 免疫組化檢測結果 與Control組相比，HFD組大鼠FXR陽性率顯著下降(P<0.05)，CYP7A1陽性率顯著上升(P<0.05)。與HFD組相比，Simvastatin組、QH組FXR陽性率顯著升高(P值均<0.05)，Simvastatin組、QH組、QL組CYP7A1陽性率顯著下降(P值均<0.05)(表5、圖2)。

表5 小腸FXR、肝臟CYP7A1陽性率

圖2 大鼠免疫組化切片(×400)

3 討論

脂質在肝臟中過度沉積，是NASH的主要成因之一，在NASH狀態下機體常出現異常升高的BA[3]，BA進一步促進腸道對脂質的攝取，加速脂肪在肝臟的堆積。FXR-FGF19通路抑制BA合成不僅能減少機體對脂質的吸收，也能減少過度產生的BA對肝臟的刺激，減輕炎癥反應[7-8]。

在正常狀態下，BA的合成與負反饋調控共同維持其穩態，但在NASH的病理狀態下FXR-FGF19通路受到抑制，無法正常發揮BA的調節功能[9-11]。本實驗中，NASH模型大鼠出現了顯著的BA合成量增加(P<0.05)，可能與病理狀態下FXR-FGF19通路抑制有關。去脂軟肝方干預后，FXR-FGF19通路重新激活，小腸FXR、肝臟FGF19上升，肝臟BA得到了顯著的抑制(P<0.05)，且肝組織病理切片的脂質沉積有所改善，提示去脂軟肝方可能具有調節FXR-FGF19通路的功能，并可能通過該途徑減少脂質吸收，改善NASH脂質沉積。

去脂軟肝方由云南省肝病專家、榮譽名中醫蘇漣教授擬方，臨床療效較好，課題組研究發現，去脂軟肝方能改善高脂誘導脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝組織脂肪變性[12]，以及血液流變學相關指標[13]，減少肝組織血管性血友病因子(vWF)分泌，抑制血小板聚集[14]，并通過調節Oatp2b1等有機離子轉運肽在不同器官的表達來改善NAFLD病變程度[15]，且對NLRP3炎癥小體合成有抑制作用[16]。現代研究表明，方中白術[17]、山楂[18]、菊花[19]皆有保肝作用；青皮含有右旋檸檬烯，橙皮苷等有效成分，具有抗休克、抑制胃腸平滑肌收縮等作用[20]；三七中含有豐富的皂苷類、黃酮類等化學成分，具有預防心腦血管系統疾病、抗腫瘤、調節新陳代謝和生理功能、保護機體肝腎功能等作用[21]。

本研究采用高脂飲食建立NASH模型，發現去脂軟肝方對FXR-FGF19通路有激活作用，這可能是該方發揮降脂作用的機制之一。 FXR在腸、肝、腎均有分布，通路復雜，且與糖脂代謝密切相關，本研究只初步探索了去脂軟肝方對FXR-FGF19通路的影響，而該方對其他FXR相關通路的影響還有待研究。

倫理學聲明：本研究方案于2020年6月1日經由云南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，批號:R-06202016，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：夏恩蕊負責課題設計，資料分析，撰寫論文；夏恩蕊、張素妍、田格格參與動物造模及實驗，修改論文；張順貞負責實驗設計擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。