肝癌生物樣本庫的標準化建立與信息化管理

喻晶晶， 肖 巍， 李婭妮， 張必翔， 陳孝平， 舒 暢

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 肝臟外科中心， 武漢 430000

肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，在常見的惡性腫瘤中，肝癌發病率位居全國第五，死亡率居第二，據估測每年新發肝癌病例46萬例，5年相對生存率僅為12.1%。肝癌的發病機制復雜，其發生發展與多種危險因素相關，如病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪性肝病、黃曲霉素等。目前，治療肝癌的最有效方法為手術切除，早期診斷和治療是提高手術療效的關鍵[1-4]。因此，開發早期檢測工具和創新型靶向藥物是提升早期診斷準確度、增強肝癌臨床治療效果的有效途徑，目前相關研究主要集中在：(1)發現提高早期預測和診斷能力的精準生物標志物；(2)揭示肝癌發生發展的關鍵基因及信號通路；(3)藥物研發的潛在分子機制分析及藥品有效性、安全性評估；(4)個體化精準治療方案的探索。上述研究均需建立在高質量的人體生物樣本的采集、保存及管理之上。

生物樣本庫作為病因學研究的重要資源平臺，其在基礎醫學研究邁向精準醫學研究的過程中發揮了重要作用。近年來，隨著醫學研究對高質量生物樣本的迫切需求，不同類型的人類生物樣本庫建設在世界各大醫學院、醫療機構中獲得快速發展。早期國際上出現的英國生物樣本庫、泛歐洲生物樣本庫與分子生物資源研究中心及美國國家癌癥研究所下屬的生物樣本庫和生物樣本研究分會等，均為疾病的病因學研究提供了可靠的樣本資源。我國生物樣本庫在國家醫學科技發展規劃下得到了跨越式發展，涌現了一批以人口為導向和以疾病為導向的不同類型的生物樣本庫。其中，以疾病為導向的臨床生物樣本庫由于其復雜性，通常起源于醫療機構，建立在醫院內部，有自己獨立的操作空間和管理制度[5-7]。該類型臨床生物樣本庫目前已有廣泛的應用，例如以腫瘤為主的生物樣本庫、特殊疾病生物樣本庫等，這些樣本庫均為相關研究提供了重要樣本資源[8-13]。

2012年以前，同濟醫院肝臟外科肝癌相關研究的臨床樣本根據課題的不同需求，由各課題組成員分別完成采集、保存和管理工作，操作流程與要求不一致，樣本質量參差不齊，臨床數據與隨訪信息也缺少統一標準，利用率較低。2012年，同濟醫院正式組建了生物樣本庫與生物資源研究中心，聚焦肝癌樣本的采集、保存與管理，為國家重大科技專項“病毒性肝炎相關肝癌樣本庫的建設維護及基線水平調查”的研究提供了強有力支撐。本文主要總結了2012年—2020年肝臟外科生物樣本庫樣本儲存情況，根據采集、保存、出入庫及信息管理等流程，制定標準化操作制度和信息化管理措施，并對已入庫保存的冷凍樣本質量進行評估，擬構建一個合格的生物資源研究平臺，為肝癌研究提供高質量的臨床樣本和臨床數據信息。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究的所有樣本來源于2012年8月—2020年12月就診于華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院肝臟外科的肝癌患者，納入標準：(1)術前影像學診斷為肝癌；(2)擬進行腹腔鏡切除術或開腹手術；(3)術后病理診斷為肝細胞癌。排除標準：(1)術后病理診斷為良性腫瘤或非肝癌的惡性腫瘤；(2)其他腫瘤轉移至肝臟的轉移性癌。排除后的樣本將納入其他疾病樣本庫。

1.2 儀器設備 -80 ℃超低溫冰箱(DW-86L626，海爾，青島)，雙門及多門電冰箱(KK18V011CW，西門子，中國)，液氮罐(CY509111CN，Thermo，美國)，低溫標簽打印機(IP300，Brady，美國)，冰箱無線溫度監控系統(YB-HC004-00，海爾，青島)，二氧化碳后備系統(BZ07A0B01，海爾，青島)，生物樣本庫管理系統(BIMS，海爾，青島)，生物安全柜(HFsafe-1200A2，力康，上海)，低速離心機(L500，湘儀，湖南)，高通量組織研磨器(18-G136，新芝，寧波)，生物組織包埋機(EG1160，LEICA，德國)，石蠟切片機(RM2235，LEICA，德國)，脫水機(TP1020，LEICA，德國)，微量紫光分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo，美國)。

1.3 樣本的采集及處理

1.3.1 血液的采集及處理 對符合納排標準的患者進行術前、術中、術后外周血樣本的采集，用促凝管和抗凝管分別采集外周血各5 mL，顛倒混勻，其中促凝管3200 r/min離心10 min，置于超凈工作臺中分離血清；抗凝管全血直接分裝，-80 ℃凍存。

1.3.2 組織的采集及處理 (1)新鮮組織：對符合納排標準的患者在不影響病理診斷所需材料的前提下，進行新鮮組織樣本的采集，盡量采集未壞死癌組織，癌旁組織選擇距離癌灶邊緣3 cm處的組織樣本，遠癌組織選擇距癌灶邊緣5 cm以上或距離癌灶邊緣最遠端(或手術切緣處)的組織樣本，并對樣本進行拍攝及標注位置。組織樣本的量一般不少于200 mg，其中一份樣本加入RNALater保護液，樣本切除后迅速置于液氮中保存，整個取樣過程盡量在手術樣本離體后30 min內完成。(2)石蠟包埋組織：取材操作規范同新鮮組織，取材部位包括癌灶、癌與癌旁交界處、癌灶周圍3 cm處的癌旁組織和5 cm以外的遠癌組織。取材以癌灶為中心水平向兩側取材，盡量保證足夠大的組織樣本。取材以“遠癌-癌旁-癌與癌旁交界處-癌灶”的順序，所有組織塊進行拍攝且標明取材部位，最后用中性福爾馬林溶液固定。固定后的組織經過“取材-脫水-透明-浸蠟-包埋”過程之后，完成組織樣本的石蠟包埋。

1.3.3 糞便的采集及處理 本研究收集患者術前、術后的糞便，用取便器采集患者樣本后，將樣本置于超凈工作臺中進行分裝，每份1～2 g。其中兩份加入1.5 mL 20%無菌甘油，含2顆小鋼珠，60 Hz 60 s震蕩混勻后，吸至凍存管-80 ℃凍存；另外兩份直接-80 ℃凍存。

1.4 樣本的保存 血液、新鮮組織及糞便樣本完成采集與處理后，分裝至若干個Ep管進行低溫入庫儲存。通過生物樣本庫管理系統(BIMS)注冊患者基本信息，并關聯對應樣本信息，打印標簽條貼至各Ep管，放置于-80 ℃冰箱對應位置保存。每臺-80 ℃冰箱都配有無線溫度監控系統和二氧化碳后備系統，可設置低溫預警提示，以保證樣本低溫環境的穩定性。石蠟包埋組織同樣進行標簽與分類后，放置于石蠟柜室溫保存。

1.5 臨床數據采集及隨訪跟蹤 患者臨床數據的采集主要通過本院電子病歷系統完成，包括患者從門診到住院的所有信息，數據的內容主要是基本信息(年齡、性別、BMI等)、既往史(飲酒、吸煙、肥胖等)、基礎肝病(肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝、血吸蟲、門靜脈高壓等)、肝功能(Alb、ALT、AST、TBil、PTA、膽固醇、膽汁酸等)、影像學診斷(B超、CT、磁共振等)、治療手段及方法(腹腔鏡、開腹、切除范圍、阻斷方式等)、腫瘤特性(Child分級、BCLC分期、TNM分期、腫瘤標志物等)及術后并發癥(腹水、胸水、肝衰竭、腹腔感染等)。定期進行患者的追蹤隨訪工作，主要通過電話隨訪和門診隨訪兩種形式。

1.6 樣本質量控制與檢測 根據樣本入庫時間，隨機抽取不同年份的肝癌及癌旁冷凍組織樣本，進行總RNA的提取及檢測。按照試劑盒說明書完成RNA的提取，NanoDrop檢測其濃度，Agilent 5400檢測其完整性和純度。

1.7 樣本的管理及使用 保存好的樣本在完成病歷錄入和跟蹤隨訪后，即可投入使用。樣本庫有專門的管理小組，負責審批樣本使用權限。各研究小組成員如需使用樣本庫樣本，使用者需向樣本庫管理小組提交申請，管理小組審核批準后，交由工作人員查詢所需患者ID，找到對應樣本位置信息，完成樣本的出庫。樣本的出入庫都在低溫環境中進行。樣本出庫進入研究項目后，若研究結束時樣本全部用完，則需告知工作人員對該樣本進行注銷，若存在剩余樣本則需歸還再次入庫保存。

2 結果

2.1 樣本收集情況 2012年8月—2020年12月樣本庫共收集4190例肝癌手術患者樣本，其中包括41 718份冷凍組織樣本、18 950份石蠟包埋組織樣本、24 389份全血樣本、20 060份血清樣本和5392份糞便樣本。所收集肝癌患者的年齡范圍為13～88歲；男性占比85.1%；66.7%的患者無飲酒史；乙型肝炎和肝硬化的比例較高，分別為83.3%和73.5%；11.5%的患者伴門靜脈高壓癥(表1)。

表1 樣本庫肝癌患者基礎信息表

2.2 標準化操作流程的建立 樣本庫具有獨立的工作空間，共設置6個工作區域：樣本處理區、樣本出入庫管理區、臨床數據庫及隨訪區、質檢實驗區、-80 ℃樣本冷凍區和液氮冷凍區。本庫配備6名專職人員，冷凍區實現實時監控。根據樣本的收集、處理、保存、管理及應用，制定出一份標準的操作流程(standard operating procedure，SOP)(圖1)。

圖1 肝癌樣本庫SOP

2.3 樣本質量檢測 從樣本庫保存的冷凍組織樣本中，隨機挑選出2012年—2020年的肝癌及癌旁組織樣本18份，提取總RNA。檢測結果為A的16份樣本RNA濃度及完整性均達到高質量等級，能夠滿足后續PCR、轉錄組測序等實驗需求；2份癌組織樣本檢測結果為C，主因RNA的完整度不足，說明其質量處于中等級別，可能會影響后續實驗的進行(表2)。總體上，樣本庫組織樣本保存質量較高，少數保存時間較長的癌組織中RNA可能發生降解，從而影響了檢測結果。

表2 肝癌組織樣本RNA檢測結果

2.4 信息化數據查詢及管理 為實現各版塊數據的關聯，樣本庫建立了一套電子數據采集系統(electronic data capture system，EDC)(圖2)，將從電子病歷系統中采集的患者信息、樣本出入庫系統的樣本信息和隨訪信息進行關聯，實現模糊查詢關聯信息功能，并標注納入不同研究項目的患者及所用樣本，方便使用者查詢樣本的應用情況。

圖2 肝癌樣本庫信息管理系統

3 討論

本科室肝癌生物樣本庫的標準化建設與信息化管理為樣本質量提供了有力保障，也充分挖掘了樣本的科研價值，支撐本科室承擔的多個國家級課題順利推進，在國內外高水平期刊上發表數篇文章[14-17]。其中Song等[14]通過檢測樣本庫的肝癌組織，發現分子伴侶蛋白14-3-3σ在癌組織中表達增高，高表達的14-3-3σ與肝癌侵襲性臨床病理特征和預后不良相關。深入研究表明，14-3-3σ通過抑制表皮生長因子受體降解從而激活依賴表皮生長因子受體的ERK1/2信號通路，促進肝癌細胞的逃避失巢凋亡效應和腫瘤轉移。Liao等[15]在樣本庫肝癌組織樣本中發現pSMAD3/SMAD3與PTPRε表達呈正相關，且SMAD3或PTPRε高表達與肝癌患者預后不良相關。本文還揭示了TGFβ/SMAD3和PTPRe之間的正反饋調節，為肝癌的侵襲轉移提供新的研究思路及治療靶點。

但本樣本庫也存在一些問題，有待進一步加強改進和完善。本樣本庫建設面積200平方米，屬于以疾病為導向的小型生物樣本庫，服務對象主要是本科室醫生、科研人員和學生，受利面較窄，尚未實現與其他樣本庫的樣本與信息的共建共享。因本科室近年承擔的肝癌與腸道菌群關系研究的課題需要，本庫增加了糞便樣本的采集與保藏工作，但由于采集啟動時間較晚且人員配置不足，樣本量不大，今后需進一步增加人員配備，豐富樣本庫樣本的種類與數量，為后續課題研究提供堅實數據基礎。

在患者病歷信息的采集方面，還存在一些漏項，主要原因是電子病歷系統填寫不詳實，需進一步加強與臨床醫生間的緊密聯系，及時查詢入庫樣本來源患者的電子病歷，確保入庫樣本來源患者相關臨床信息的完整準確性，為后續隨訪信息收集等工作奠定基礎。

衡量樣本庫樣本保存質量的核心指標之一是凍存樣本的RNA檢測，從本次檢測結果來看，本樣本庫凍存7年內(2014年—2020年)的樣本質量較高，占本次檢測總量的77.8%，可滿足肝癌研究的要求；凍存7年以上(2012年—2013年)的部分組織樣本存在RNA降解的問題，占本次檢測總量的11.1%，質量較差，無法完全滿足肝癌研究的要求。在今后的樣本利用中，應進一步加快樣本利用效率，在樣本采集入庫后，盡快應用到各項課題研究中去。

工作人員的專業性是保障樣本庫持續發展的關鍵，本樣本庫專職人員均持有相關合格證書，并不定期參加國內生物樣本庫相關會議培訓，據統計，2012年—2020年參加相關會議培訓54人次。隨著國內外研究者對生物樣本庫關注度的不斷提升，新一代信息網絡技術與生物、醫療技術的迭代升級，生物樣本庫建設標準與技術正處在不斷更新提檔的快速發展期，在樣本收集、儲藏、運輸、分配、檢索、倫理、信息和安全等方面都產生了一系列規范標準[18-20]，客觀上要求樣本庫專職人員必須不斷學習，接受專業培訓，提升樣本庫建設與管理標準，努力建設成為服務肝臟基礎科研的高效生物資源研究平臺。

倫理學聲明：本研究方案于2021年7月28日經由同濟醫院倫理委員會審批，批號：TJ-IRB20210760。患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：喻晶晶參與研究的實施、數據的統計分析及文章的撰寫；肖巍、李婭妮對研究的完成有關鍵貢獻；張必翔負責指導研究思路和論文框架；陳孝平、舒暢參與研究方案的設計、文章的修訂及定稿。