急性胰腺炎胰酶異常活化和分泌的分子機制

崔恬玉， 劉瑞霞， 陰赪宏

首都醫科大學附屬北京婦產醫院 a.內科， b.中心試驗室， 北京 100026

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種臨床常見急腹癥，發病率為34/10萬，在世界范圍內呈上升趨勢[1]，其中重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)常合并嚴重并發癥，病死率達15%～35%[2-3]，嚴重威脅人民生命健康，并帶來巨大經濟負擔。這主要是由于缺乏治療AP的特效藥物，臨床治療仍以奧曲肽[4-5]、烏司他丁等藥物治療為主，但效果欠佳。因此深入探索AP發病機制，尋找理想的治療靶點十分重要。

AP的發病機理十分復雜，其中胰酶異常活化和分泌是胰腺腺泡細胞中的早期病理事件[6]，也是AP發生發展的始發因素。近年來，胰酶異常活化和分泌的細胞內分子機制研究取得新進展，本文將從胰腺腺泡細胞內病理事件和調控分子角度，歸納胰酶異常活化和分泌的機制。

1 AP胰酶異常活化的細胞內機制

胰腺外分泌部的主要生理功能是分泌胰液進入小腸，發揮消化吸收作用。胰蛋白酶原等胰酶前體是胰液的主要成分之一，由胰腺腺泡細胞合成、貯存和分泌。胰酶前體于腺泡細胞粗面內質網(endoplasmic reticulum，ER)中合成，經高爾基體加工后形成含有酶原顆粒(zymogen granules，ZG)的內吞囊泡。胰酶前體無活性，同時細胞內存在保護機制(活化后胰酶的自溶作用和特定胰酶抑制劑等)以避免胰酶前體激活，防止自身消化[7]損傷細胞。而AP早期病理損傷多由胰腺腺泡細胞中胰蛋白酶原提前激活引起。在AP相關病因(如膽結石和酒精濫用等)作用下，腺泡細胞內防止胰酶前體激活或降低胰酶活性的保護機制障礙，胰酶前體被提前活化為胰酶，進而多種酶(如彈性蛋白酶和磷脂酶A2)以及補體和激肽途徑被激活，同時促炎因子分泌增加，造成胰腺局部損傷和炎癥反應。目前胰酶異常活化的細胞機制主要包括鈣離子(Ca2+)超載、溶酶體與ZG的共定位和細胞器損傷。

1.1 Ca2+超載 胰腺腺泡細胞內Ca2+信號調控是胰酶前體激活的關鍵信號分子，而Ca2+超載是AP發生的中心事件[8]。生理環境中，副交感神經末梢釋放乙酰膽堿等刺激性神經遞質，通過胰腺腺泡細胞膜上G蛋白偶聯受體激活磷脂酶C，促進細胞膜表面的磷脂酰肌醇4，5二磷酸水解產生二級信使三磷酸肌醇(inositol 1，4，5-trisphosphate，InsP3)。InsP3作用于ER上三磷酸肌醇受體(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，InsP3Rs)，打開InsP3依賴性鈣通道，促進ER中大量Ca2+釋放入細胞質中[9]；同時細胞膜上Ca2+通道打開，胞外Ca2+內流，參與激活InsP3Rs和ryanodine受體，進一步促進Ca2+從ER釋放。最終細胞外Ca2+內流和ER中Ca2+釋放引起腺泡細胞頂端側區域的Ca2+濃度瞬時峰值，啟動酶原胞吐作用，并刺激線粒體中ATP的產生，為胰酶分泌提供能量[10]。并且胞外Ca2+內流和ER中Ca2+釋放這兩條路徑之間存在相互作用。ryanodine受體是鈣敏感通道，細胞內Ca2+濃度的輕度升高即可誘導其開放，介導Ca2+從ER釋放。Orai1通道位于胞膜上，屬于鈣庫調控的Ca2+通道，STIM1為Orai1通道的調控因子，位于ER膜上，可感知ER內Ca2+耗竭并向質膜遷移，與Orai1相互作用后打開鈣庫調控的Ca2+通道，誘導細胞外Ca2+內流[11]。

AP相關病因(高脂血癥、酒精和膽汁酸等)刺激下，腺泡細胞內出現胞外Ca2+過量流入或胞質內Ca2+清除機制異常，造成胞漿內Ca2+超載。AP時細胞膜和ER膜的通透性增加，促進胞外和ER中Ca2+過量流入細胞質中。正常情況下，胞漿內Ca2+濃度一旦過度增加，細胞可通過ER和胞膜上的Ca2+泵迅速發揮代償作用，分別將Ca2+移回ER或排出胞外[8]，清除胞質內多余Ca2+，而Ca2+泵的代償作用需要ATP供能維持。但是胞漿內Ca2+濃度持續性病理升高會導致線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)以高電導狀態打開，損傷生成ATP[12-14]所需的膜電位，導致ATP耗竭，進而直接抑制腺泡細胞內Ca2+清除作用。Mukherjee等[12]也在CD1小鼠AP模型中證實胰腺腺泡細胞內Ca2+濃度持續升高可打開MPTP，造成胰腺腺泡細胞內線粒體損傷、ATP生產受阻；敲除MPTP基因及藥物阻滯MPTP后發現胰腺腺泡細胞內線粒體損傷減輕，ATP生成水平正常，進一步證實了抑制MPTP開放對AP線粒體損傷和ATP耗竭的保護作用。

AP時Ca2+超載可激活Ca2+/鈣調蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶鈣調神經磷酸酶(calmodulin-dependent serine/threonine phosphatase calcineurin，PP2B)，促進酶原活化[7]。Shah等[15]利用PP2B抑制劑FK506分別于1 h和8 h干預AP小鼠，發現與1 h相比8 h小鼠胰腺內胰蛋白酶活性降低50%以上，血清淀粉酶降低86%，提示AP早期胰蛋白酶活化與PP2B活性相關。此外，Ca2+也可作為輔助因子參與胰酶自身激活過程，促進胰蛋白酶提前活化。雖然腺泡細胞內存在胰蛋白酶抑制劑，可通過降解胞質內低活性胰酶來自我保護，避免自消化損傷。但Ca2+可與胰蛋白酶激活肽的氮端天冬氨酸殘基結合，增強胰酶的穩定性和活性，降低胰蛋白酶抑制劑對腺泡細胞的保護作用。已有研究[16]證實，增加的腺泡細胞內Ca2+的濃度可直接促進胰蛋白酶原的激活。Dantrolene是RyR的藥理拮抗劑，Orabi等[17]使用Dantrolene(RyR拮抗劑)干預AP小鼠，通過減弱胰腺腺泡胞Ca2+內流降低胞漿內Ca2+濃度，發現酶原激活水平以及胰腺損傷程度均減輕。

1.2 溶酶體與ZG的共定位 胰酶以非活性ZG形式貯存于腺泡細胞胞質中。在AP早期階段，腺泡細胞內溶酶體和ZG生成增加，并且二者發生融合現象，此過程稱為共定位，導致胰蛋白酶原提前活化[6]。ZG與溶酶體融合后，組織蛋白酶 B(CathepsinB, CatB)(一種主要的溶酶體酶)將胰蛋白酶原激活為具有消化功能的胰酶[18]。胰酶和CatB從內吞液泡內釋放的機理尚未完全闡明，有研究者[19]認為活化后的胰酶可引起膜脆性的增加，導致內吞液泡泄漏，釋放胰酶和CatB；還有研究[20]認為，發生共定位的內吞液泡可能會誘使細胞骨架和/或細胞器破裂；溶酶體和ZG膜也可能分別由于酒精的代謝產物和膜穩定糖蛋白2的缺失而變得脆弱。上述原因均可能促進內吞液泡釋放胰酶，在腺泡細胞內外引起自身消化，造成胰腺損傷和全身炎癥反應[21]，加速AP的發生發展。

1.3 細胞器損傷 AP可通過損傷ER和線粒體等細胞器功能，促進胰酶提前激活。ER是調節蛋白質合成、折疊和聚集的重要細胞器。ER可通過泛素-蛋白酶體途徑將未折疊或錯誤折疊的蛋白質清除，保證合成蛋白質的質量。外部刺激(如氧化應激或Ca2+超載)可引發ER中錯誤折疊的蛋白質過度聚集，導致內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS也是早期AP腺泡細胞中的重要反應，實驗性AP中，早期ERS的發生與胰蛋白酶原激活有關[22-23]。AP腺泡細胞內線粒體損傷-ATP耗竭-胰酶激活過程與Ca2+超載密切相關。

ERS和線粒體損傷除直接參與胰酶激活外，也與AP自噬損傷有關。自噬是一種細胞保護機制，可處理和回收陳舊、有缺陷或已損壞的各種細胞質內容物[24]。AP腺泡細胞溶酶體功能障礙，促使溶酶體內組織蛋白酶L(降解胰蛋白酶原和胰酶，抑制CatB激活胰蛋白酶原)和CatB比例失衡，導致自噬損傷，促進自噬泡內胰蛋白酶原激活[25]。自噬受損也會加重ERS和線粒體功能損傷，導致腺泡細胞更易遭受其他損傷和死亡[26-29]。Hashimoto等[30]利用雨蛙素誘導自噬相關基因5敲除的AP小鼠模型發現，胰腺腺泡細胞內ZG的激活受到抑制，AP嚴重程度顯著降低。

腺泡細胞中的細胞器形成了一個聯動系統，任何細胞器受損可能都會導致整個網絡的故障。例如，通過ATG5或ATG7的遺傳消融或通過核因子κB激酶亞基抑制劑的基因缺失來阻止自噬，均導致ERS和線粒體功能紊亂，無法生成ATP，且由于胰蛋白酶原合成于ER，腺泡細胞合成和分泌胰酶功能也發生障礙[24,31]。相反，通過CypD基因消融恢復線粒體功能可減輕ERS并增加實驗性AP中溶酶體-自噬系統的性能[26]。雖然已有大量研究發現腺泡細胞細胞器之間的相互作用可影響胰酶活化，甚至影響AP病程發展，但其具體分子機制仍需深入挖掘。

2 AP胰酶分泌抑制的細胞機制

生理刺激下，胰腺腺泡細胞內頂端側Ca2+濃度出現瞬時峰值，促使內吞囊泡向腺泡細胞頂端側運輸，最終與頂端側胞膜融合，將酶原釋放入腺泡管內(胰酶頂端側分泌)。酶原后進入十二指腸，被腸激酶等消化酶活化后發揮生理功能。AP時患者胰酶腸道分泌減少，胰腺組織和血液中胰酶濃度增加，這是由腺泡細胞頂端側分泌受阻以及基底側分泌增強導致的。細胞內堆積的ZG被提前激活后進入胰腺組織，導致胰腺局部損傷和炎癥反應；進入血液后可造成全身炎癥反應，促進SAP的發生發展。

2.1 VAMP8介導的頂端側分泌受損和基底側分泌增強(圖1)

VAMP(vesicle associated membrane protein，VAMP)8和VAMP2屬于SNARE家族，廣泛存在于包裹ZG的囊泡(內體)膜上，VAMP8和VAMP2是正常生理狀態下介導胰酶頂端側分泌的主要蛋白。然而AP時VAMP8介導的腺泡細胞胰酶頂端側分泌路徑完全阻斷，僅50%胰酶通過VAMP2介導的頂端側分泌，導致細胞內ZG堆積[32]，胰酶分泌受阻。堆積的ZG更易與溶酶體發生共定位，導致胰酶提前活化。Messenger等[32]證實，超大劑量胰酶分泌激動劑刺激野生型和VAMP8基因敲除小鼠后，VAMP8基因敲除AP小鼠分離的胰腺腺泡細胞內ZG堆積水平較野生型小鼠增加了4.5倍，但ZG與溶酶體共定位減少，最終腺泡細胞內胰酶活性無明顯變化，提示VAMP8除參與ZG頂端側分泌外，還可能與囊泡間融合相關。

正常胰腺腺泡細胞中ZG分泌后，頂端側擴大的早期內體隔室通過Rab5介導的內體順行運輸，回收質膜和VAMP8等胞吐相關蛋白，并且Rab5介導的內體順行運輸系統可促進 ZG裝配VAMP8，維持VAMP8介導的ZG頂端側分泌。說明在生理狀態下胰腺腺泡細胞VAMP8介導的ZG頂端側分泌依賴于Rab5參與調控的內體運輸[33]。AP時Rab5減少，導致VAMP8介導的ZG頂端側分泌路徑受損，ZG轉而與晚期內體、溶酶體融合并提前活化，向基底側逆向轉運[34]。Messenger等[34-35]還發現無胰酶分泌激動劑刺激時，Rab5過表達能促進VAMP8介導的ZG頂端側分泌，上調胰酶基礎分泌；Rab5過表達也可減少ZG與溶酶體融合，抑制胰酶提前活化。

2.2 肌動蛋白細胞骨架破壞和融合孔擴張不足 肌動蛋白絲在調節胰腺腺泡細胞頂端側分泌中起重要作用，超最大劑量的雨蛙素可造成末端肌動蛋白網及其相關的中間絲的損失。Chvanov等[36]于免疫電鏡下觀察發現，過度刺激下胰腺腺泡細胞內肌動蛋白絲無法完整包裹ZG運載囊泡，進而囊泡出現相互融合、破裂，最終ZG頂端側分泌胞吐作用受損；然而基底側胞膜肌動蛋白絲增加，這可能與胰酶基底側增強有關。因此胰酶分泌阻滯可能是與膽囊收縮素過量刺激破壞肌蛋白細胞骨架有關，但詳細分子調控尚不明確。

生理狀態下，運載ZG的內吞囊泡與腺泡細胞頂端膜結合后形成足夠大的融合孔，酶原通過融合孔釋放入腺泡管內，目前認為依賴ATP供能的融合孔擴張在ZG分泌中起關鍵作用。AP致使融合孔擴張不足，造成酶原等大分子蛋白質無法通過融合孔，頂端側分泌受阻，也有研究者認為融合孔擴張不足與細胞內Ca2+超載引起的ATP耗竭有關[37]，融合孔擴張不足的具體機制同樣不明確。

圖1 VAMP8介導的頂端側分泌受損和基底側分泌增強示意圖

3 結語

胰酶異常活化和分泌是AP發生發展的關鍵因素。早期胰腺腺泡細胞內Ca2+超載、溶酶體與ZG的共定位和細胞器損傷均可導致胰酶提前活化；而胰酶頂端側分泌受阻和基底側分泌增加、肌動蛋白細胞骨架破壞和融合孔擴張不足可致胰酶異常分泌。胰酶異常活化和分泌可直接促進全身炎癥反應和多器官系統損傷的發生，導致SAP，增加病死率。因此深入探索胰酶異常活化和分泌的細胞機制，尋找早期阻斷AP發生發展的靶向治療藥物十分關鍵，可有效降低SAP的發生率和病死率。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：崔恬玉負責擬定寫作思路，檢索文獻，撰寫論文；劉瑞霞、陰赪宏負責指導、修改論文并最終定稿。