藤黃有效成分的納米囊制備及其抗糖尿病活性評價

戰鶴 韓璐 何忠梅 時坤 趙巖 宗穎 陳維佳 杜銳

中圖分類號 R944 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）09-1075-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.09

摘 要 目的 制備藤黃酸（GA）、新藤黃酸（NGA）的納米囊（GA-LNCs、NGA-LNCs），并進行其抗糖尿病活性評價。方法 以水為水相、中鏈甘油三酯為油相、聚乙二醇單硬脂酸酯為表面活性劑，采用相轉換法制備GA-LNCs、NGA-LNCs。以包封率和載藥量為指標，利用單純型網格設計法優化上述2種納米囊的處方工藝，并對其理化性質進行考察。建立糖尿病小鼠模型，灌胃給予GA-LNCs、NGA-LNCs（劑量分別為1.92、2.42 mg/kg），每天1次，連續給藥6周，檢測小鼠空腹血糖值和血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。結果 這2種納米囊的最優處方均為60%水、10%中鏈甘油三酯、30%聚乙二醇單硬脂酸酯（三者總量固定為2 g）以及35 mg GA或NGA。以最優處方制得的GA-LNCs、NGA-LNCs的包封率分別為（92.01±0.68）%、（93.12±2.11）%，載藥量分別為（0.99±0.21）%、（1.21±0.22）%;兩者均為黃色均一透明液體，無沉淀，微觀形態均為類球形，且具有明顯的殼膜結構，粒徑分別為（28.11±9.76）、（22.06±6.84） nm，Zeta電位分別為（-4.09±1.00）、（-17.40±1.32） mV，多分散系數分別為0.93±0.06、0.74±0.12。動物實驗結果顯示，GA-LNCs、NGA-LNCs均可顯著升高模型小鼠血清中SOD、GSH-Px活性和HDL-C含量（P<0.05或P<0.01），顯著降低模型小鼠空腹血糖值和血清中MDA、TC、TG、LDL-C含量（P<0.05或P<0.01）。結論 本研究制得的GA-LNCs、NGA-LNCs理化性質良好，且具有良好的抗糖尿病活性。

關鍵詞 藤黃酸;新藤黃酸;納米囊;糖尿病;制備

Preparation of nanocapsules of active ingredients of Garcinia hanburyi and evaluation of their antidiabetic activity

ZHAN He1，HAN Lu1，HE Zhongmei1，SHI Kun1，ZHAO Yan1，ZONG Ying1，CHEN Weijia1，DU Rui1，2，3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1. College of Chinese Medicinal Materials， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Key Laboratory of Animal Production， Product Quality and Security， Ministry of Education of China， Changchun 130118， China; 3. Jilin Provincial Engineering Research Center for Efficient Breeding and Product Development of Sika Deer of China， Changchun 130118， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To prepare Gambogic acid （GA） nanocapsules （GA-LNCs） and Neogambogic acid （NGA） nanocapsules （NGA-LNCs）， and to evaluate their antidiabetic activities. ?METHODS Using water as the aqueous phase， medium- chain triglyceride as the oil phase and polyethylene glycol monostearate as the surfactant， GA-LNCs and NGA-LNCs were prepared by phase inversion method. Using entrapment efficiency and drug-loading amount as index， the formulation technologies of above 2 nanocapsules were optimized by simplex lattice design. Its physical and chemical properties were investigated. The diabetic mice model was established. GA-LNCs and NGA-LNCs （1.92 and 2.42 mg/kg respectively） were given intragastrically， once a day， for consecutive 6 weeks. The fasting blood glucose of mice， the activities of superoxide dismutase （SOD） and glutathione peroxidase （GSH-Px）， the contents of malondialdehyde （MDA）， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） were all detected. RESULTS The optimal formulation of 2 kinds of nanocapsules included 60% water， 10% medium-chain triglyceride， 30% polyethylene glycol monostearate （total amount of the three was 2 g） and 35 mg GA or NGA. The encapsulation efficiencies of GA-LNCs and NGA-LNC obtained by the optimal formulation were （92.01±0.68）% and （93.12±2.11）%; the drug-loading amount were （0.99±0.21）% and （1.21±0.22）%， respectively. GA-LNCs and NGA-LNCs were yellow， homogeneous and transparent liquid without precipitation. They were spherical in microscopic shape， and had obvious shell- membrane structure. The particle sizes were （28.11±9.76） and （22.06±6.84） nm; Zeta potential were （-4.09±1.00） and （-17.40±1.32） mV， and polydispersity were 0.93±0.06 and 0.74±0.12. The results of animal experiments showed that both GA-LNCs and NGA-LNCs could significantly increase the activities of SOD and GSH-Px and the serum content of HDL-C （P<0.05 or P<0.01） in model mice， and significantly decreased the fasting blood glucose and the serum contents of MDA， TC， TG and LDL-C （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS GA-LNCs， NGA-LNCs prepared in this study are good in physical and chemical properties and have good anti-diabetes activity.

KEYWORDS ? gambogic acid; neogambogic acid; nanocapsules; diabetes; preparation

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種由遺傳、環境和自身免疫等復合病因所引起的慢性代謝性疾病，其可誘發微血管和大血管病變、神經系統并發癥等[1]。2020年全國流行病學統計顯示，我國糖尿病患者總人數約1.298億，且患病率保持持續增長的趨勢[2]。目前，治療DM的藥物只能短暫地使患者血糖水平正常化[3]。因此，從天然產物中尋找治療DM且毒副作用小的藥物是當今研究的熱點。

藤黃為雙子葉植物藤黃科藤黃屬植物藤黃Garci- nia hanburyi Hook. f.的膠狀樹脂[4]，早在《海藥本草》中就有記載，現收錄于《中藥大辭典》中，其味酸澀、性涼、有毒，具有治療癰疽腫毒、頑癬惡瘡、損傷出血等功效[5-6]。現代研究表明，藤黃還具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、神經保護等作用[7-11];其主要含有以藤黃酸（gambogic acid，GA）和新藤黃酸（neogambogic acid，NGA）為代表的籠狀氧雜蒽酮類成分[12-13]。這2種成分均具有較好的抗腫瘤效果，可通過多途徑抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移，并誘導細胞凋亡[14]。另外，本課題組也首次發現，GA和NGA均具有降血糖作用，且該項研究成果已獲國家授權發明專利（專利號為ZL 2014 1 0092956.9）[15] 。但這2種成分均具有一定刺激性，且難溶于水、生物利用度較低、血管刺激性較大[16-17]，因此極大地限制了其臨床應用。

納米制劑包括納米粒、納米囊等，粒徑介于1～1 000 nm，性質穩定、制備簡便[18];且其對人體無毒，生物相容性較好，包載藥物后可降低對正常器官、組織及全身的副作用，并改善難溶性藥物的溶解度[19-21]。納米囊根據成囊材料的不同可分為聚合物納米囊和類脂納米囊[22-23]。其中，類脂納米囊是核-殼結構的新型載藥系統，類似脂蛋白的結構，主要包裹親脂藥物[24]?；诖耍狙芯坎捎孟噢D換法[25]將GA、NGA制成納米囊（即類脂納米囊），對其粒徑、微觀形態、Zeta電位、X-射線衍射等理化性質以及體外抗DM活性進行考察，以期為DM新藥開發提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），2489 型紫外可見光分光光度計（美國Waters公司），BS210S型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司），FD-IC50型真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司），MIX15 eco型磁力加速攪拌器（常州市國旺儀器制造有限公司），FEI G2 120KV型透射電鏡、m3000型馬爾文激光粒度分析儀、BeNano 90 Zeta 型納米粒度電位儀（丹東百特儀器有限公司），TGL-16M型低速離心機（上?？蒲派锟萍加邢薰荆?，DNM- 9602型酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司），活力型羅氏血糖儀（杭州歐英米電子商務有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

GA、NGA原料藥由本實驗室自制（質量分數均大于98%）;本研究所用其他藥品與試劑有：大孔吸附樹脂D101（天津市光復精細化工研究所，批號1021Q011），中鏈甘油三酯、葡聚糖凝膠G-50、二甲雙胍（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為20111028、413B052、H20051277），聚乙二醇單硬脂酸酯（上海麥克林生化科技有限公司，批號20150905），D-甘露醇（北京酷來博科技有限公司，批號20110603 ），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，美國Sigma 公司，批號WXBC6558V），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high- density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20180608、20210417、20120323、20181129、20181116、20181129、20181116）;GA、NGA對照品（成都德思特生物技術有限公司，批號分別為DT0015、DX0071，純度均大于98%）;其余試劑為實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF 級C57BL/6J 小鼠，共 60只，雄性，體質量為18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008。將小鼠飼養于溫度 20～26 ℃、相對濕度 40%～70%的條件下，期間自由飲水與攝食，適應性飼養 1周后進行實驗。

2 方法與結果

2.1 GA、NGA的含量測定

2.1.1 溶液的配制 （1）對照品溶液的配制：分別精密稱取GA、NGA對照品2.00 mg，置于10 mL量瓶中，以乙腈定容，分別制成GA、NGA質量濃度均為0.20 mg/mL的對照品溶液，備用。（2）供試品溶液的配制：分別精密吸取“2.2.1”項下GA納米囊（GA-LNCs）、NGA納米囊（NGA-LNCs）0.1 mL至不同10 mL量瓶中，以乙腈定容，即得GA-LNCs、NGA-LNCs供試品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Silversil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（90 ∶ 10，V/V）;流速為1 mL/min;檢測波長為360 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

2.1.3 專屬性試驗 取“2.1.1”項下GA、NGA對照品溶液和GA-LNCs、NGA-LNCs供試品溶液適量，按“2.1.2”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖。結果顯示，各樣品中GA和NGA的峰形均較好，且不受輔料及空白溶劑的影響，結果見圖1。

2.1.4 線性關系考察 取“2.1.1”項下GA、NGA對照品溶液適量，分別制成質量濃度均為0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的系列溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，以各對照品的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。結果顯示，GA、NGA的回歸方程分別為Y=14 970X-33（R2=0.999 6）、Y=10 050X-17（R2=0.999 6），檢測質量濃度線性范圍均為0.01～0.20 mg/mL。

2.1.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.1.1”項下GA、NGA對照品溶液適量，按“2.1.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，GA、NGA峰面積的RSD分別為0.87%、0.99%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取GA-LNCs、NGA-LNCs適量，各6份，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，根據標準曲線計算GA、NGA的含量。結果顯示，GA-LNCs、NGA-LNCs中GA、NGA的平均含量分別為9.01、8.64 mg/g，RSD分別為0.88%、1.42%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 取GA-LNCs、NGA-LNCs適量，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，然后于室溫放置0、4、6、12、24、48 h后，按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，GA、NGA峰面積的RSD分別為0.98%、1.66%（n=6），表明這2種供試品溶液在室溫放置48 h內穩定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 吸取已知GA、NGA含量的GA-LNCs、NGA-LNCs供試品溶液，各6份，分別加入GA對照品760.47 μg、NGA對照品526.48 μg，然后按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果顯示，GA、NGA的平均加樣回收率分別為98.94%、97.63%，RSD分別為2.05%、3.69%（n=6）。結果見表1。

2.2 GA-LNCs、NGA-LNCs的制備工藝研究

2.2.1 納米囊的制備 采用相轉化法[25]進行制備。以中鏈甘油三酯為油相、水為水相、聚乙二醇單硬脂酸酯為表面活性劑[26]，按相應比例混合后，加入GA 或NGA原料藥35 mg，于室溫下勻速攪拌至藥物溶解;控制攪拌溫度使其勻速上升或下降，完成室溫→85 ℃→60 ℃→85 ℃→60 ℃→85 ℃→72 ℃的循環，以形成穩定的均相體系;當溫度下降至70 ℃左右時，立即加入適量冰水并攪拌均勻，形成均一穩定的透明溶液，即得相應納米囊。

2.2.2 載藥量和包封率的測定 將葡聚糖凝膠G-50充分溶脹在水中24 h，然后填入注射器使水分自然濾出，再將注射器置于15 mL離心管中，以500 r/min離心1 min，除去多余的水分，即得凝膠柱。取所制得的納米囊100 μL均勻加入凝膠柱，洗脫5次，每次用0.1 mL水洗脫，收集洗脫液，置于5 mL量瓶中，加入乙腈定容，按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，并計算包入的藥量W1。另取100 μL納米囊，加入乙腈定容至5 mL，按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，并計算總藥量W2。 然后根據公式計算載藥量和包封率：載藥量=W1/W3×100%（W3為納米囊的總質量），包封率=W1/W2×100%。

2.2.3 網格法優化GA-LNCs、NGA-LNCs的處方 以包封率和載藥量為優化指標，以水相、油相、表面活性劑的比例為考察因素（固定總量為2 g），采用{3，2}單純型網格設計法對GA-LNCs、NGA-LNCs的處方工藝進行優化[26]。GA-LNCs、NGA-LNCs單純型網格法實驗設計和結果見表2、表3。進一步通過Origin作圖分析，得到載藥量和包封率的三維圖和等高線圖，兩者等高線圖的疊加部分為載藥量和包封率均較高的區域，即形成納米囊的最優處方，結果見圖2、圖3。結果顯示，當油相比例越小、水相比例越大時，GA-LNCs、NGA-LNCs的載藥量和包封率均越高。由此可知，GA-LNCs、NGA-LNCs的最優處方均為60%水、10%中鏈甘油三酯、30%聚乙二醇單硬脂酸酯（三者總量固定為2 g）以及35 mg GA或NGA。

2.2.4 處方驗證 按“2.2.3”項下優化的處方工藝，制備GA-LNCs、NGA-LNCs，平行3批，然后測定其包封率和載藥量。結果顯示，GA-LNCs的包封率和載藥量分別為（92.01±0.68）%、（0.99±0.21）%，NGA-LNCs的包封率和載藥量分別為（93.12±2.11）%、（1.21±0.22）%。

2.3 GA-LNCs、NGA-LNCs的理化性質考察

2.3.1 外觀性狀觀察 取“2.2.4”項下制備的GA-LNCs、NGA-LNCs適量，加入冰水，于室溫條件下放置24 h后，觀察其是否有沉淀。結果顯示，GA-LNCs、NGA-LNCs均為黃色均一透明液體，且均無沉淀。

2.3.2 透射電鏡觀察 取“2.2.4”項下制備的GA-LNCs、NGA-LNCs適量，以水稀釋后，滴加至銅網，再以2%磷鎢酸染色，待自然晾干后，采用透射電鏡進行觀察。結果顯示，GA-LNCs、NGA-LNCs均為類球形，大小均勻，且具有明顯的殼膜結構。結果見圖4。

2.3.3 粒徑、Zeta電位、多分散系數的測定 取“2.2.4”項下制備的GA-LNCs、NGA-LNCs適量，采用馬爾文激光粒度分析儀和納米粒度電位儀測定其粒徑、Zeta電位、多分散系數（polydispersity，PDI）。結果顯示，GA-LNCs、NGA-LNCs的粒徑分別為（28.11±9.76）、（22.06±6.84） nm，Zeta電位分別為（-4.09±1.00）、（-17.40±1.32） mV，PDI分別為0.93±0.06、0.74±0.12。

2.3.4 X-射線衍射分析 X-射線衍射分析是研究藥物晶體結構的有效手段，不同的晶體結構在不同位置會有強吸收峰。本研究選擇甘露醇作為凍干保護劑，在GA-LNCs制備完成后加入甘露醇攪拌至溶解，以保護GA-LNCs的形態結構。取GA原料藥、甘露醇、GA-LNCs（以甘露醇凍干）、甘露醇與GA-LNCs的物理混合物進行X-射線衍射分析。設置管壓為40 kV，管流為40 mA，衍射角2 θ范圍為10°～70°，掃描速度為4°/min。結果顯示，GA存在晶型結構，主要衍射峰在23.15°，甘露醇衍射峰在18.26°，二者的吸收峰峰形均較為尖銳。在物理混合物中GA與甘露醇均以晶體形式存在，所以同時顯示二者的吸收峰。GA-LNCs在凍干前加入甘露醇來防止納米囊結構被破壞，使GA被包裹進納米囊中，所以GA-LNCs的X-射線衍射圖譜中沒有GA的吸收峰，這說明GA被有效地包裹在納米囊中。結果見圖5。

2.4 GA-LNCs、NGA-LNCs抗DM活性評價

將小鼠隨機分為對照組（以普通飼料飼養）和造模組（以高脂高糖飼料飼養），飼養期間每隔7 d對小鼠空腹血糖值（fasting blood glucose，FBG）進行檢測。5周后，各組小鼠禁食不禁水12 h，造模組小鼠腹腔注射100 mg/kg STZ溶液，對照組同法注射等量檸檬酸緩沖液，72 h后，檢測小鼠FBG，當FBG>11.1 mmol/L時，表明造模成功[27]。將造模成功的小鼠隨機分為模型組、陽性對照組（二甲雙胍200 mg/kg，劑量根據文獻[27]設置）、GA-LNCs組（1.92 mg/kg，劑量根據預實驗結果設置，以GA計）、NGA-LNCs組（2.42 mg/kg，劑量根據預實驗結果設置，以NGA計），每組8只。對照組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，其余各組小鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續給藥6周。末次給藥12 h后（禁食），取血，離心取上清液備用，采用相應試劑盒檢測各組小鼠血清中 SOD、GSH-Px 活性和 MDA、TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。采用 SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，結果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性和HDL-C含量均顯著降低（P<0.01），FBG和MDA、TC、TG、LDL-C含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性和HDL-C含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），FBG（從給藥第2周起）和MDA、TC、TG、LDL-C含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結果見表4、圖6。

3 討論

本研究將GA和NGA通過相轉換法制成納米囊，以改善兩者的口服生物利用度，以期為DM新藥開發提供參考。在相轉換法中，以不同比例水相、油相、表面活性劑制備的納米囊呈不同色澤，按部分比例制得的納米囊為混懸液而非澄清溶液?；诖耍狙芯抗潭{米囊總量，以包封率和載藥量為指標，采用單純型網格法，優化GA-LNCs、NGA-LNCs水相、油相、表面活性劑的比例。結果表明，當水相為60%、油相為10%、表面活性劑為30%時，制得的納米囊較為穩定。進一步觀察其外觀形態、粒徑、Zeta電位、PDI等理化性質發現，GA-LNCs、NGA-LNCs均為黃色均一透明液體，無沉淀，且在透射電鏡下顯示為類球形，具有明顯殼膜結構，粒子間分散狀態也較為良好;粒徑在20～30 nm范圍內，這可能是由于GA和NGA中的酚羥基可與表面活性劑上的羧基發生酯化作用，使得粒徑較小。

本課題組前期檢測發現，NGA在檢測范圍內沒有衍射峰，所以本研究僅考察了GA原料藥及其納米囊制劑的衍射圖譜。結果發現，GA與甘露醇物理混合后，其圖譜中同時存在甘露醇和GA的衍射峰，而在GA-LNCs（含有凍干保護劑甘露醇）圖譜中未檢測到GA的衍射峰，這表明GA被穩定地包封在納米囊中，而不是單獨存在。

DM引發的并發癥與氧化應激反應有關，氧化應激可導致MDA含量升高以及SOD、GSH-Px活性降低，其中MDA可造成DNA和蛋白質的損傷，而SOD和GSH-Px可清除體內自由基，從而抑制氧化應激反應，提高機體抗氧化能力[28]。本研究結果顯示，與模型組比較，GA-LNCs組和NGA-LNCs組小鼠血清中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低，這表明GA-LNCs、NGA-LNCs均可通過抗氧化途徑發揮抗DM作用。

DM患者胰島功能不足，體內脂質代謝酶活性隨之下降，從而促進血脂升高，進而導致心血管疾病的發生[29]。本研究結果顯示，與模型組比較，GA-LNCs組和NGA-LNCs組小鼠血清中HDL-C含量均顯著升高，TC、TG、LDL-C含量均顯著降低，表明GA-LNCs、NGA-LNCs均可有效調節DM模型小鼠的脂質代謝紊亂。

綜上所述，本研究成功制備了藤黃2種有效成分的納米囊，這2種納米囊的理化性質良好，且具有較好的抗DM活性，可為藤黃的進一步合理開發及應用提供參考。

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（收稿日期：2021-12-03 修回日期：2022-03-25）

（編輯：唐曉蓮）