不同尖孢鐮刀菌對蓮藕致病力差異與防治試劑篩選

高澤普，佟 靜，王寶駒，盧彩鴿，王麗萍，王素娜，武占會(huì)*

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究所，北京 100097；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3.河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038；4.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100097)

尖孢鐮刀菌可造成多種植物發(fā)生腐敗病、枯萎病等嚴(yán)重病害，可通過侵染蓮藕地下根部，逐漸蔓延至地下莖及全株，常造成蓮藕根狀莖變褐腐爛，同時(shí)地上部分的葉、花由于輸導(dǎo)機(jī)能受阻而干枯卷曲，嚴(yán)重的甚至?xí)斐缮徟褐仓晁劳觥Ｄ壳埃苡行Х乐紊徟焊瘮〔〉幕瘜W(xué)藥劑種類較少且藥劑施用劑量過多，對周圍環(huán)境、微生物甚至人類造成危害。通過驗(yàn)證不同尖孢鐮刀菌對蓮藕的致病力情況，并有針對性地篩選出1種高效防治蓮藕腐敗病的化學(xué)藥劑和施用劑量，以及篩選出1種綠色生物防治方法，以減少對環(huán)境的污染，這對蓮藕腐敗病的防治與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)具有重大意義。

已有研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉菌和枯草芽孢桿菌都可以作為生防菌對尖孢鐮刀菌有一定的拮抗作用。為明確生防菌防治蓮藕腐敗病的效果，試驗(yàn)先期選擇在室內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，以期為下一步進(jìn)行大田應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌

選取從蓮藕莖部分離的尖孢鐮刀菌（F），蓮藕根部分離的尖孢鐮刀菌（F）與從甜瓜根腐病病株上分離的尖孢鐮刀菌（F）為供試菌株。供試菌株均從發(fā)病部位分離并純化培養(yǎng)獲得。

1.1.2 供試蓮藕

藕塊：從藕田中采收新鮮嫩藕，洗凈，用無菌水沖洗若干次，取中間段切成厚度為3 cm的藕塊后供試。

藕葉：采取新鮮、健康無病、大小均勻的初展嫩葉后放入提前配置好的基礎(chǔ)營養(yǎng)液中，其中基礎(chǔ)營養(yǎng)液采用日本鴨兒芹營養(yǎng)液配方（四水硝酸鈣236 mg/L，硝酸鉀708 mg/L，磷酸二氫銨192 mg/L，七水硫酸鎂246 mg/L）。

1.1.3 供試藥劑與生物制劑

供試藥劑3種：硫·酮多菌靈、波爾多液和酸性氧化電位液體敷料；供試生物制劑2種：哈茨木霉菌劑、枯草芽孢桿菌劑（表1）。

表1 供試試劑有效成分含量及其來源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌致病力試驗(yàn)

藕塊接種：將在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的3種尖孢鐮刀菌用7.0 mm無菌打孔器打孔，在菌落邊緣切取菌絲塊，將菌絲塊接種在藕塊中央位置，菌絲塊的菌絲面朝下與藕片接觸，每個(gè)藕片放置1個(gè)菌絲塊，接種后放置在溫度為（25±1） ℃，濕度≥90%的環(huán)境中保濕培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)12片。

藕葉接種：與藕塊接種方式相同，將藕葉以葉長半徑與葉短半徑之間的連線為分界線，均勻分為4個(gè)等份，將菌絲塊接種到每份中央距離葉邊距5 cm處，每等份葉片上放置1塊菌絲塊，菌絲塊上放置1團(tuán)滅菌的棉球保濕，與接種藕塊放入相同環(huán)境條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)6片藕葉。

以在藕塊、藕葉上接種滅菌的馬鈴薯瓊脂塊作為對照，第7天記錄各處理發(fā)病率（發(fā)病率＝發(fā)病藕塊或藕葉/總數(shù)×100%），并根據(jù)表2、表3腐敗病分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病級數(shù)，計(jì)算病情指數(shù)（病情指數(shù)＝∑（各級病株數(shù)×該病級值）/（總數(shù)×最高等級）×100）。

表2 蓮藕腐敗病分級標(biāo)準(zhǔn)

表3 蓮藕腐敗病分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 藥劑平板抑菌試驗(yàn)

病原菌培養(yǎng)：各供試病原菌經(jīng)PDA培養(yǎng)基在（25±1）℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)7 d后備用。藥劑毒力：采用生長速率法進(jìn)行測定，將供試化學(xué)藥劑用無菌水調(diào)配成相應(yīng)的濃度梯度（表4）。其中硫·酮多菌靈與波爾多液采用巴氏消毒法滅菌30 min，在超凈工作臺(tái)分別吸取2 mL藥劑與18 mL經(jīng)121 ℃滅菌20 min后的PDA培養(yǎng)基混勻冷卻后備用；酸性氧化電位液體敷料采用表面噴施PDA培養(yǎng)基2 mL后在黑暗密閉的條件下備用，需現(xiàn)用現(xiàn)配。生物菌劑抑制率：采用對峙培養(yǎng)法進(jìn)行測定，將生物菌劑活化后調(diào)配成相應(yīng)濃度（表4），使用1 mL移液槍在距離平板邊緣2 cm處滴1次，每個(gè)平板對稱滴4個(gè)位置。

將供試平板準(zhǔn)備好后，用直徑7.0 mm的滅菌打孔器沿著病原菌培養(yǎng)基的菌落邊緣切取菌絲塊（菌餅），將菌絲塊與培養(yǎng)基中央貼合，每個(gè)培養(yǎng)皿放1塊菌餅。以滅菌培養(yǎng)基為空白對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。經(jīng)（25±1）℃恒溫培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量各處理菌落直徑平均值，并計(jì)算菌絲生長抑制率。抑制率＝（對照純生長量－處理菌落純生長量）/對照純生長量×100%；純生長量＝菌落平均直徑－菌餅直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對尖孢鐮刀菌的抑制效果

室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，供試藥劑中對蓮藕腐敗病的致病菌防治效果最好的為硫·酮多菌靈，在設(shè)計(jì)的濃度梯度范圍內(nèi)對3種供試菌株的菌絲生長均達(dá)到100.0%的抑菌率。波爾多液處于濃度≥1.0 g/L時(shí)，對F的防治效果可達(dá)61.0%以上，對F、F的抑菌率≤40%。低濃度的酸性氧化電位液體敷料對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制效果差，甚至沒有效果，僅濃度最高即60 mg/L時(shí)，對F、F、F的抑菌率可至41.0%以上。2種生物菌劑也表現(xiàn)出了較好的抑菌效果，哈茨木霉菌劑在濃度為3.0 g/L時(shí)對F、F、F抑菌率達(dá)到最高值，分別為78.8%、86.7%、76.9%。枯草芽孢桿菌劑在濃度為3.0 g/L時(shí)，對F、F、F的抑菌率分別達(dá)到最高，即65.0%、60.0%、46.2%。

表4 不同藥劑對尖孢鐮刀菌的抑制效果

2.2 不同尖孢鐮刀菌對蓮藕的致病力差異

采用菌絲塊接種的方式將3種尖孢鐮刀菌接種蓮藕，從接種的藕塊與藕葉發(fā)病情況表明，不同的接種病原菌都可以導(dǎo)致離體蓮藕發(fā)病，并且在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行接種的腐敗病癥狀與自然環(huán)境下感染的腐敗病癥狀相同。將接種的蓮藕發(fā)病部位分離純化得到的病原菌進(jìn)行形態(tài)觀察和回接驗(yàn)證均與原始菌株完全一致。

供試的藕塊與藕葉發(fā)病情況如表5所示，F(xiàn)發(fā)病率與病情指數(shù)高于其他病原菌，藕塊接種病原菌的發(fā)病率達(dá)100.0%。在實(shí)驗(yàn)室平板培養(yǎng)中，相同時(shí)間內(nèi)F的純生長量最高，說明其生長速率也最高。F對蓮藕的致病力次于F。F的致病力最弱，病情指數(shù)也最低。雖然供試的3種病原菌同屬于鐮刀菌屬，但F和F對蓮藕致病性卻表現(xiàn)出了顯著差異，F(xiàn)和F表現(xiàn)差異不顯著。

表5 各處理發(fā)病情況

3 結(jié)論與討論

通過形態(tài)學(xué)與分子鑒定的手段發(fā)現(xiàn)造成蓮藕發(fā)生腐敗病的病原菌主要為，其與蓮藕致病菌尖孢鐮刀菌.是近緣關(guān)系，且通過病藕的ITS序列分析后發(fā)現(xiàn).和.都可以使蓮藕感染腐敗病。致病力試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)以蓮藕為供試材料的.的致病力和病情指數(shù)要高于.，而從甜瓜病株上分離出的尖孢鐮刀菌侵染程度較低，在自然環(huán)境下可能并不會(huì)造成健康的蓮藕植株感病。

在藥劑平板抑菌試驗(yàn)中，硫·酮多菌靈對蓮藕腐敗病的抑菌率最高，在設(shè)置的濃度梯度下均可100.0%抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長，波爾多液在高濃度下（≥1.0 g/L）對才表現(xiàn)出較好的抑制率，可作為土壤或種藕的消毒劑使用，而酸性氧化電位液體敷料主要成分為次氯酸，常作為消毒劑使用，對環(huán)境污染較小，但對3種鐮刀菌的防治效果較差，因此不建議作為防治藥劑使用。生防菌防治試驗(yàn)表明，哈茨木霉菌劑（3.0 g/L）對的防治效果最高可達(dá)78.8%，枯草芽孢桿菌劑在3.0 g/L用量下對的防治效果達(dá)65.0%，這2種生防菌劑對尖孢鐮刀菌都起到了很好的抑制效果。由于這2種菌的拮抗機(jī)制不同，哈茨木霉菌通過重寄生機(jī)制，枯草芽孢桿菌是通過拮抗機(jī)制進(jìn)行防治。下一步可以試驗(yàn)將2種生防菌聯(lián)合防治蓮藕腐敗病，其效果有可能優(yōu)于單一生防菌劑。

由于本研究篩選出的藥劑和生物制劑僅在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，篩選生防菌的種類只有1種生防真菌和1種生防細(xì)菌，從實(shí)際栽培的角度出發(fā)，復(fù)雜的自然環(huán)境條件下或許存在更多的生防菌對蓮藕腐敗病病原菌有拮抗作用；因此，還應(yīng)從蓮藕根際土壤中取樣，篩選更多對鐮刀菌有拮抗作用的生防菌，并進(jìn)行綜合分析。若要將防治試劑大面積推廣給農(nóng)戶施用，還需要進(jìn)一步進(jìn)行模擬藕田的真實(shí)種植環(huán)境試驗(yàn)，以提供更加科學(xué)、規(guī)范的蓮藕腐敗病防治方法。