紅景天苷對(duì)高氧致新生小鼠支氣管肺發(fā)育不良的保護(hù)作用研究*

王小勤，幸黔魯，馬一翔

(遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，貴州 遵義 563000)

隨著呼吸機(jī)的廣泛使用，危重癥新生兒救治水平逐年提高，早產(chǎn)兒成活率逐年上升，而支氣管肺發(fā)育不良(BPD)作為機(jī)械通氣或高濃度吸氧的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)生率亦逐年增高，嚴(yán)重影響新生兒生存質(zhì)量，造成了嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。BPD的組織病理學(xué)改變主要為炎癥、肺泡祖細(xì)胞分化受損、肺組織纖維化等因素導(dǎo)致的肺泡發(fā)育障礙[2]。目前，針對(duì)BPD的分子策略和有效的治療方法仍然不明確。紅景天苷作為藏藥紅景天的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)氧化、抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[3-4]。本研究通過(guò)構(gòu)建新生小鼠BPD模型，探討了紅景天苷對(duì)新生小鼠BPD的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 36只24 h內(nèi)出生的C57BL/6J新生小鼠(體重14～20 g，雌雄不限)購(gòu)自遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，紅景天苷購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2方法 將C57BL/6J新生小鼠隨機(jī)分為常氧組、高氧組、紅景天苷組，每組12只。常氧組新生小鼠暴露于室內(nèi)空氣中由母鼠喂養(yǎng)，高氧組、紅景天苷組新生小鼠置于自制氧氣箱中飼養(yǎng)[5]，母鼠與小鼠同箱。氧箱條件：氧濃度維持在60%以上，箱內(nèi)置鈉石灰使CO2水平小于0.5%，溫度為25～27 ℃，濕度為50%～70%。每天持續(xù)給氧23.5 h，上午定時(shí)開(kāi)艙0.5 h以添加食物、水及更換墊料。14 d后暴露于室內(nèi)空氣中飼養(yǎng)。紅景天苷組每天腹腔內(nèi)注射紅景天苷40 mg/kg，常氧組、高氧組腹腔內(nèi)注射等體積0.9%生理鹽水。

經(jīng)眼球取血1 mL,室溫下血液自然凝固20 min后，在4 ℃條件下，1 000×g離心10 min，然后將上清液等量分裝并于-20 ℃下保存(24 h內(nèi)檢測(cè)可于2～8 ℃下保存)。按ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。使用5%戊巴比妥以70 mg/kg腹腔注射麻醉后處死小鼠，剪開(kāi)胸腔取出肺組織，左上肺行蘇木精-伊紅(HE)染色，左下肺葉行免疫印跡法檢測(cè)。取小鼠右肺組織即刻稱重，記為濕質(zhì)量(W)，然后放入60 ℃烤箱，48 h后再次稱重3次，取平均值記為干質(zhì)量(D)，以W/D值表示肺組織含水量。取小鼠左上肺于10%福爾馬林固定24 h，經(jīng)脫水、通透、包埋、切片(厚度為5～6 μm)、二甲苯脫水脫蠟、HE染色后封片，倒置顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)變化。每只小鼠HE染色圖片隨機(jī)選取至少20個(gè)高倍視野(400×)，采用MATUTE-BELLO等[6]肺損傷評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行肺損傷評(píng)分。取小鼠左下肺葉提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、Smad7蛋白表達(dá)水平，按每孔25 μg的上樣量等體積行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)模和封閉后，放入一抗稀釋液(1∶1 000)中于4 ℃孵育過(guò)夜,TBST清洗后放于二抗(1∶2 000)中于37 ℃孵育2 h,洗膜,加發(fā)光液,置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光,拍照后利用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組HE染色及肺損傷評(píng)分比較 HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)高氧暴露后，新生小鼠出現(xiàn)肺泡發(fā)育障礙，表現(xiàn)為肺泡數(shù)量相對(duì)減少，肺泡間隔厚度增加，肺組織毛細(xì)血管形態(tài)破壞。各組HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1。高氧組肺損傷評(píng)分[(0.310±0.015)分]明顯高于常氧組[(0.080±0.016)分]和紅景天苷組[(0.200±0.012)分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.常氧組；B.高氧組；C.紅景天苷組。

2.2各組肺組織W/D值比較 高氧組肺組織W/D值[(4.550±0.014)]明顯高于常氧組[(3.440±0.236)]和紅景天苷組[(3.950±0.142)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 高氧組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于常氧組和紅景天苷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4各組肺組織NF-κB、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 高氧組肺組織NF-κB、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平與常氧組和紅景天苷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

1.常氧組；2.高氧組；3.紅景天苷組。

表2 各組肺組織NF-κB、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

BPD是影響早產(chǎn)兒的最常見(jiàn)并發(fā)癥，目前尚無(wú)治愈方法。雖然，嬰兒可以從BPD中恢復(fù)，但部分患兒在成年后會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，表現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)育障礙、哮喘和肺氣腫改變[7-8]。BPD的典型特征是肺泡生長(zhǎng)發(fā)育異常、肺泡簡(jiǎn)化、血管發(fā)育受損及肺功能異常[9]。紅景天苷作為藏藥紅景天的提取物，具有延緩衰老、抑制炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等特性,并具有高效低毒的藥理學(xué)特點(diǎn)[10]。LAN等[11]研究證實(shí)，紅景天苷可通過(guò)上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1調(diào)控NF-κB/高遷移率族蛋白1信號(hào)途徑，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。然而,紅景天苷對(duì)高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD是否具有保護(hù)和治療效果，仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，高氧組和紅景天苷組新生小鼠持續(xù)暴露于60%的高濃度氧氣14 d后，均出現(xiàn)不同程度肺泡發(fā)育異常，表現(xiàn)為肺泡數(shù)量相對(duì)減少，肺泡間隔厚度增加，肺組織毛細(xì)血管形態(tài)破壞，且肺損傷評(píng)分顯著升高。肺泡毛細(xì)血管屏障通透性改變的病理生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是肺組織W/D值改變[6]。本研究結(jié)果顯示，高氧暴露后，小鼠肺組織W/D值明顯升高，且IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，而經(jīng)紅景天苷治療后，小鼠各炎癥指標(biāo)水平明顯降低，且肺泡毛細(xì)血管屏障通透性好轉(zhuǎn)，肺泡發(fā)育受損情況得到明顯改善，與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果一致。提示紅景天苷不但具有抗炎作用，同時(shí)具有促進(jìn)肺泡發(fā)育、減輕肺損傷的作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smads信號(hào)通路具有趨化和促進(jìn)增殖作用，可刺激、誘導(dǎo)各種炎癥及纖維化因子表達(dá)，促進(jìn)肺間質(zhì)轉(zhuǎn)化，造成肺泡發(fā)育受損[13]。Smad7作為TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)的增強(qiáng)可顯著抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制肺纖維化進(jìn)程[14]。有研究表明，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中,Smad7的上調(diào)可顯著抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路，調(diào)控肺泡間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。本研究結(jié)果顯示，高氧暴露后，Smad7蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而經(jīng)紅景天苷治療后，Smad7蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。提示紅景天苷可促進(jìn)Smad7表達(dá)，從而抑制TGF-β1/Smad7信號(hào)通路，調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

NF-κB信號(hào)通路是炎性反應(yīng)的重要信號(hào)通路,在膿毒癥、急性呼吸窘迫綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病中起促進(jìn)作用[16]。NF-κB作為一種極其重要的核轉(zhuǎn)錄因子[17],參與多種生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖分化、血管再生、炎癥、肺泡化等過(guò)程。有研究顯示,NF-κB具有雙向調(diào)節(jié)作用,炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1β、TNF-α可通過(guò)激活NF-κB通路,啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答,而NF-κB的磷酸化可顯著促進(jìn)IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá),從而加重炎性反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，高氧組血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平與肺組織NF-κB相對(duì)表達(dá)水平顯著高于常氧組,提示高氧介導(dǎo)的BPD增強(qiáng)了NF-κB的磷酸化，促進(jìn)了炎性反應(yīng)的加重。而經(jīng)紅景天苷治療后,小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平和肺組織NF-κB相對(duì)表達(dá)水平明顯降低,提示紅景天苷可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎性反應(yīng),發(fā)揮修復(fù)BPD新生小鼠肺損傷的作用。

綜上所述，紅景天苷可能通過(guò)調(diào)控NF-κB及TGF-β1/Smad7信號(hào)通路抑制炎性反應(yīng)及肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而對(duì)新生小鼠BPD發(fā)揮保護(hù)作用。本研究不足之處：未抑制或沉默NF-κB和TGF-β1信號(hào)通路，以進(jìn)一步研究紅景天苷對(duì)新生小鼠BPD保護(hù)作用的分子機(jī)制。