ApoA5基因rs651821位點多態性與侗族人群代謝綜合征的關系研究*

杭遠欣，王海英，周太梅，肖玉波

(湖南醫藥學院公共衛生與檢驗醫學院，湖南 懷化 418000)

代謝綜合征(MS)是腹型肥胖、高血壓、高血糖、高甘油三酯(TG)血癥和(或)低高密度脂蛋白水平等因素聚集在同一個體上發生的一種代謝異常癥候群，基因與環境因素均可導致該病的發生[1]。位于載脂蛋白A5(ApoA5)基因起始密碼子上游3 bp的單核苷酸多態性(SNP)位點rs651821，被證實與血清TG水平升高有關，并可能導致湖南侗族人群對高血壓的易感性增加[2]，而該位點基因多態性與MS的相關性研究較少見[3]。本研究探討了ApoA5基因SNP位點rs651821與侗族人群MS發生風險之間的關系，對篩選MS易感人群、降低MS發生率有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月在湖南省通道侗族自治縣某衛生院就診的160例MS患者作為MS組，同時選取145例健康體檢者作為對照組。納入標準：符合2007年《中國成人血脂異常防治指南》的診斷標準[4]，即男性腰圍大于或等于85 cm，女性腰圍大于或等于80 cm；收縮壓/舒張壓大于或等于140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)；空腹血糖(FPG)大于或等于6.10 mmol/L；TG≥1.7 mmol/L；男性高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<0.9 mmol/L，女性HDL-C<1.03 mmol/L，其中3項及以上異常時診斷為MS。排除標準：長期使用類固醇激素等藥物；合并結締組織疾病、繼發性高血壓、慢性肝病；未簽署知情同意書。本研究獲得湖南醫藥學院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。2組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2主要儀器及試劑 主要儀器設備：SW-CJ-1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設備廠)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)；TG16-Ⅱ型臺式高速離心機(湖南平凡科技有限公司)；聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀(美國ABI公司)；DYY-8型穩壓穩流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司)；H6-1微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠)；凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；U-3010紫外可見分光光度計(日本Hitachi公司)；微量電子天平(北京博遠祥德科學儀器有限公司)；BS-460型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)。主要試劑：DNA細胞裂解液、核糖核酸酶、蛋白酶K、苯酚、氯仿、乙酸銨、無水乙醇、75%乙醇、引物、PCR試劑盒、DNA標記物、限制性核酸內切酶、瓊脂糖等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3方法 采用調查表對所有受試者進行性別、年齡、身高、體重、腰圍、血壓等一般資料的收集，其中血壓、腰圍的測量由同一名護士連續測量3次，并記錄3次的平均值。清晨空腹采血，分裝并于—80 ℃保存。采用全自動生化分析儀檢測FPG、TG、總膽固醇(TC)、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

查詢ApoA5基因rs651821位點序列，利用Primer5.0設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中上游引物為5′-GTT GAA GTC AGG GTC GGA GA-3′，下游引物為5′-GTA ACA GGA TTT CGG GCA GT-3′。采用酚-氯仿法提取外周血白細胞中基因組DNA。采用PCR-限制性片段長度多態性(PCR-RELP)方法檢測基因多態性。PCR反應體系：DNA模板0.5 μL、10×Taq Buffer 1.5 μL、2.5 mM三磷酸脫氧核苷0.3 μL、上游引物和下游引物(50 pmoL/μL)各0.2 μL、Taq酶(5 U/μL)0.1 μL、Mg2+1.2 μL、ddH2O補至15 μL。PCR擴增循環參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，68.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共20循環；然后95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共20循環；最后72 ℃延伸6 min。RELP反應體系15 μL，包含PCR產物10 μL，10×Buffer R 1.5 μL，Acc36Ⅰ限制性核酸內切酶(10 U/μL)0.1 μL，ddH2O 3.4 μL，在37 ℃下消化過夜。酶切產物電泳：制作1%瓊脂糖凝膠并加入溴化乙啶(0.5 μg/mL)，將8 μL酶切產物加入膠孔，以6 μL DNA標記物為參照物，電泳30 min(120 V)，在凝膠成像系統中觀察結果。

2 結 果

2.12組臨床及生化指標比較 MS組體重、體重指數、腰圍、FPG、收縮壓、舒張壓、TC、TG、LDL-C水平高于對照組，而身高、HDL-C水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組臨床及生化指標比較

2.2PCR-RFLP檢測和測序情況 ApoA5基因rs651821位點經Acc36Ⅰ酶切后，根據片段長度的不同對基因型進行判斷，共檢測到3種基因型，具體如下：TT基因型(119、38 bp)，TC基因型(157、119、38 bp)，CC基因型(157 bp)。見圖1。為保證準確性，通過直接測序進一步確定基因型，各基因型測序峰圖(正向測序)與酶切產物電泳結果一致。見圖2。因為38 bp的核苷酸序列分子量小，電泳后無法在凝膠上顯示，但不影響基因型的判讀。

M為500 bp DNA標記物。

圖2 ApoA5基因rs651821位點基因型測序圖

2.32組基因型和等位基因頻率分布情況 經χ2檢驗，2組基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2=0.495，P>0.05)，說明樣本具有代表性，可反映整體基因分布情況。2組基因型和等位基因頻率分布情況比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組基因型和等位基因頻率分布情況[n(%)]

2.4各基因型攜帶者臨床及生化指標比較 3種基因型攜帶者體重指數、舒張壓、HDL-C、LDL-C水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。CC基因型攜帶者腰圍、收縮壓、TC、TG水平高于TC、TT基因型攜帶者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各基因型攜帶者臨床及生化指標比較

2.5ApoA5基因rs651821多態性與MS易感性的關系 排除年齡、性別和體重指數的影響后，TC基因型攜帶者患MS的風險是TT型攜帶者的1.743倍(95%CI：0.843～3.604，P<0.05)，CC基因型攜帶者患MS的風險是TT型攜帶者的11.508倍(95%CI：3.296～40.185，P<0.05)。見表4。

表4 ApoA5基因rs651821位點基因多態性與MS易感性的關系

續表4 ApoA5基因rs651821位點基因多態性與MS易感性的關系

3 討 論

近年來，MS發生率逐年升高，已成為威脅人類健康的主要公共衛生問題之一。有研究顯示，2016—2017年，20～70周歲普通居民MS發生率增長至19.58%，其中男性為26.97%，女性為16.18%[5]。有研究表明，MS患者罹患糖尿病、心血管疾病和癌癥的風險均顯著增加[6-7]。除了非遺傳因素如吸煙、飲酒和飲食等以外，遺傳因素與MS之間的關系逐漸成為研究熱點。國內外大量研究揭示了MS與多個基因的SNP存在相關性，如MG53基因[8-9]、IGF2BP2基因[10-11]、MC4R基因[8,12]等。

ApoA5基因是2001年發現的血漿載脂蛋白家族新成員，位于人類染色體11q23區域，由4個外顯子和3個內含子組成，毗鄰ApoA1/ApoC3/ApoA4基因簇，編碼一種參與調節血漿TG和HDL-C水平的載脂蛋白[13]。ApoA5基因至少含有23個SNP位點，其SNP位點對高血壓、血脂、血糖及心血管疾病影響的研究較多見[14-15]。研究已證實，ApoA5基因-1131T>C位點基因多態性與高脂血癥顯著相關，且可增加MS發生率[16-18]。rs662799(-1131T>C)和rs2266788(1259T>C)多態性與人群血脂代謝密切相關，其中rs662799(-1131T>C)被證實在匈牙利、日本、中國北方漢族人群中與MS顯著有關，是MS的獨立危險因素[19-22]。

本研究結果顯示，MS組CC基因型及C等位基因頻率分布顯著高于對照組(P<0.05)。提示C型基因突變可能導致個體MS易感性增高，但其分子機制有待進一步探討和研究。同時，本研究單獨分析了不同基因型與臨床及生化指標之間的關系，結果顯示，CC基因型與腰圍、收縮壓、TC、TG水平密切相關，易導致MS的發生。此外，logistic回歸分析顯示，TC基因型攜帶者患MS的風險是TT基因型攜帶者的1.743倍，CC基因型攜帶者患MS的風險是TT基因型攜帶者的11.508倍。提示通道侗族自治縣侗族人群ApoA5基因rs651821位點的變異會增加MS的發生風險，其中CC基因型OR值較大，其原因可能是樣本量少、數據不均勻。受樣本量及試驗方法的限制，本研究僅對侗族人群rs651821位點進行了研究，ApoA5基因的其他變異體與MS的關系尚需進一步研究。

綜上所述，在通道侗族自治縣侗族人群中，ApoA5基因rs651821位點多態性與MS密切相關，攜帶CC基因型人群發生MS的風險會升高。