響應面優化咖啡山荊子復合飲料的制備工藝

李澤林 趙春燕 張楠 丁媛婧 范江平 沈曉靜,2,3

（1.云南農業大學食品科學技術學院 云南昆明 650201；2.云南農業大學理學院 云南昆明 650201；3.云南省天然藥物重點實驗室/昆明醫科大學 云南昆明 650500）

咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，主要分布在南美、中美洲、非洲和亞洲等國家，全球超過80個國家種植[1]，具有醒神、利尿、健胃的功效，主治精神倦怠、食欲不振，常作為醒神、利尿和健胃藥使用。現代研究表明，咖啡中含有生物堿、酚酸類、黃酮類、萜類等多種活性成分，具有肝臟保護、神經保護、抗氧化、降血糖、抗糖尿病等多種藥理活性[2-4]。

此外，咖啡因其獨特的風味而成為世界三大飲品之首，且已成為全球第二大貿易商品。我國咖啡種植以小粒咖啡為主，且99%以上分布在云南的德宏、普洱、保山、西雙版納、臨滄等地[5]。云南獨特的地理環境、高原氣候和多樣復雜的生態系統，造就了云南小粒咖啡內含物質豐富，除咖啡因、綠原酸、葫蘆巴堿等成分外，還含有mascarosides I～II、paniculoside VI、cofaryloside I和 villanovane Ⅰ[6]、caffarolides A～H[7]、caffruenol A-B、caffruones A-D[8]和 caffruolide A-B[9]等一些新型萜類化合物。其中，caffarolides C、D 和 F被證實具有一定的體外激活血小板聚集的活性；caffruenol A-B和caffruolide A-B具有抑制脂多糖誘導的264.7巨噬細胞NO產生的作用。同時，這些化合物的差異也使得云南小粒咖啡果實多油、多果香味，口感濃而不苦，香而不烈，具有較高的杯測值，備受大眾喜愛[10-11]。

近年來，云南小粒咖啡產業發展迅速，世界性消費越來越多，因此，小粒咖啡也被加工成各種形式的咖啡產品以提高其價值[12]。如楊洋等[13]優化了小粒咖啡乳飲料產品配方；王燕等[14]以咖啡為主要原料，按40%綠豆汁、0.5%咖啡、9%蔗糖，0.02%黃原膠、0.1% CMC-Na和0.01%海藻酸鈉的配方研制了綠豆咖啡復合飲料；還有紅豆咖啡[15]、枸杞咖啡[16]、苦丁茶牛奶咖啡[17]等多種復合飲料被研制。此外，王祥[18]還以咖啡和決明子為原料研制了決明子-咖啡降脂復合飲料。

麗江山荊子[Malus rockii Rehd.(M.baccata var.himalaica (Maxim.) Schneid.]又名麗江山定子、喜馬拉雅山荊子、海棠果，屬薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）山荊子系植物，是云南麗江特有的一種野生水果[19]。成熟的麗江山荊子呈鮮紅色，酸甜可口、細脆多汁，深得當地居民的喜愛[20]。《中國納西康巴醫藥學》中記載了麗江山荊子可緩解兒童小便不暢和關節疼痛，后證實是山荊子中含有的多酚以及花青素類生物活性物質發揮了重要作用[21-22]。此外，麗江山荊子中含有的表兒茶素也是一類具有抗炎癥、抗菌抗氧化等活性的黃酮類物質。李澤林等[23]研究發現，表兒茶素可以通過調節體內代謝物緩解急性肺損傷炎癥。王玉涵等[24]發現，表兒茶素對四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化有一定的保護作用。據當地居民介紹，山荊子主要是切片曬干當做零食食用，少數用來制作泡酒，很少有文獻報道用其制作復合飲料，目前還得不到廣泛的應用及開發。

本文以感官評分為考察指標，采用云南小粒種咖啡和麗江山荊子為原料，通過 Box-Behnken中心組合實驗優化云南小粒咖啡山荊子復合飲料的工藝，并檢測其微生物指標及抗氧化活性，旨在為云南小粒咖啡和麗江山荊子的綜合運用以及深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材深度烘焙咖啡豆（卡蒂姆），云南朱苦拉咖啡有限公司；麗江山荊子，采自云南省麗江市；白砂糖，耿馬南華糖業有限公司；檸檬酸、異抗壞血酸鈉，昆明順佳商貿有限公司；大腸桿菌測試片，廣東達元綠洲食品安全科技股份有限公司；DPPH、ABTS+分析純，天津市興復精細化工有限公司；食品級羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉和β-葡聚糖，河南恩苗食品有限公司。

1.1.2 儀器L18-Y916榨汁機，九陽股份有限公司；CK5300咖啡豆研磨機，Cafede Kona公司；APV-1000高壓均質機，深圳市榮利豐科技有限公司；JC-SY-1恒溫水浴鍋，南通嘉程儀器有限公司；HX1002Z電子天平，慈溪市天東衡器廠；UV-2600紫外分光光度計，北京京科瑞達科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程咖啡液和山荊子果汁調配→均質→脫氣→預熱→灌裝→封口→殺菌→冷卻→成品。

1.2.2 原料預處理（1）咖啡液的提取：咖啡粉碎后，過 40目篩，按料液比 1:15（g/mL）90℃水沖泡后，濾紙過濾，冷卻到室溫待用。

（2）山荊子果汁的制備：選擇無蟲害、顏色偏紅、果實體完好的果子，清洗去核。按山荊子鮮果:水 1:1.5（g/mL）的料液比榨汁，4層紗布過濾3次，加入0.2%異抗壞血酸鈉護色15 min，待用。

（3）0.2%復合穩定劑：參考黃玉坤等[25]的方法，按羧甲基纖維素鈉∶海藻酸鈉∶β-葡聚糖質量比2:1:1制備。

1.2.3 復合飲料的制備（1）調配：按照一定的體積比加入咖啡液和山荊子果汁，再加入白砂糖、檸檬酸進行預混，最后加入0.2%的復合穩定劑加熱攪拌溶解，待基本溶解完全后殺菌30 min。

（2）均質、脫氣：25 MPa，50℃條件均質，重復2次；均質完成后，放涼脫氣。

（3）預熱、罐裝、封口、殺菌：罐裝前60℃預熱10 min，玻璃罐沸水煮10 min滅菌；將飲料灌裝后，沸水浴滅菌30 min，冷卻至室溫得成品。

1.2.4 單因素試驗按照工藝流程，分別對原料配比、白砂糖添加量、檸檬酸添加量進行調控，對咖啡山荊子復合飲料的工藝進行優化研究。

（1）原料配比（咖啡液:山荊子果汁）：固定白砂糖添加量（20%），檸檬酸添加量（0.04%），考察原料配比（V/V，4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3）對咖啡山荊子復合飲料感官品質的影響。

（2）白砂糖添加量：固定原料配比（V/V，4:1），檸檬酸添加量（0.04%），考察白砂糖添加量（5%、10%、15%、20%、25%、30%），對咖啡山荊子復合飲料感官品質的影響。

（3）檸檬酸添加量：固定原料配比（V/V，4:1），白砂糖添加量（20%），考察檸檬酸添加量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）對咖啡山荊子復合飲料感官品質的影響。

1.2.5 復合飲料響應面優化試驗在單因素的基礎上，以咖啡山荊子復合飲料感官評分為響應值，利用響應面法設計咖啡山荊子復合飲料的制備工藝，根據Box-Behnken實驗設計，利用三因素三水平的試驗優化咖啡山荊子復合飲料工藝配方，如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.6 檢測分析

1.2.6 .1 感官評定以色澤、口感、香味、組織狀態為感官評價指標，參考石文貞[26]、楊呂清等[27]等方法，選取嗅覺、味覺敏感且無不良嗜好，有復合飲料相關領域品評經驗的專業人士10人（男女各5名）組成評鑒小組，采用盲樣評定法對復合飲料的色澤、口感、香味、組織狀態進行評分，評分標準見表2。

表2 感官評價標準表

1.2.6 .2 微生物指標的測定按照 GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》、GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》和 GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》進行菌落總數、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等微生物測定。

1.2.6 .3 抗氧化能力的測定分別采用 DPPH自由基清除實驗和ABTS自由基清除實驗2種方法對復合飲料的抗氧化能力進行評價。

（1）DPPH自由基清除能力參照Victoria等[28]的方法。準確吸取2 mL待測樣品溶液，分別加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L），混合均勻后，避光放置30 min，以蒸餾水調零，在517 nm處測定吸光度。設定3組平行，取平均值作為最終結果。DPPH自由基清除率按以下公式計算：

式中：A0為蒸餾水代替樣品時對照溶液的吸光度；A1為DPPH用無水乙醇代替時樣品溶液的吸光度；A2為測試樣品溶液的吸光度。

（2）ABTS+自由基清除能力參照周春峰等[29]的方法。將88 μL的過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）和5 mL ABTS+溶液（7 mmol/L）混合，于黑暗條件下放置24 h，生產ABTS+自由基儲備液。然后，以50倍體積稀釋上述儲備液，使其在734 nm處吸光度為(0.70 ± 0.02)，即得到ABTS+溶液。

吸取不同的待測樣品溶液200 μL于試管內，加入3 mL的ABTS+溶液，空白組用純水代替樣品液，對照組用純水代替ABTS+溶液，上述3組溶液在室溫下避光放置1 h后，于734 nm處測定吸光值，設定3組平行，取平均值作為最終結果。按照以下公式計算清除率：

式中：A0為純水代替樣品時溶液的吸光度；A1為純水代替ABTS+溶液時樣品溶液的吸光度；A2為測試樣品溶液的吸光度。

1.2.7 數據處理響應面試驗設計與數據分析采用Design-Expert.V 8.0.6軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 原料配比對復合飲料感官品質的影響隨著咖啡原液添加量降低，復合飲料咖啡苦味降低、既有咖啡的色澤，又能體現山荊子的果香，感官評分增加。在原料配比為 2:1時其感官評分達到最大值，為87.7分（圖1）。但是當果汁含量逐漸增多時，成品果味較濃，獨特的咖啡風味減少，果酸味增加，復合飲料酸味增加，咖啡色消失，被接受程度降低。所以，選擇咖啡原料∶山荊子果汁2:1為最優值作為后續研究。

圖1 原料配比對復合飲料感官品質的影響

2.1.2 白砂糖添加量對復合飲料感官品質的影響隨著白砂糖添加量增加，復合飲料的甜度增加。當白砂糖的添加量為20%時，成品感官評分最高，為90.8分（圖2）。添加量小于20%時，因山荊子果汁本身的酸味和檸檬酸的酸味疊加復合飲料的口感偏酸；當添加量大于20%時，復合飲料的咖啡味和果味被增大的甜度掩蓋。所以選擇白砂糖添加量20%為最優值作為后續研究。

圖2 白砂糖添加量對復合飲料感官評分的影響

2.1.3 檸檬酸添加量對復合飲料感官品質的影響檸檬酸不僅可以抑菌、護色、改進產品風味、促進蔗糖轉化，還可以促進食欲且對身體無副作用。由圖3可知，成品感官評分在檸檬酸添加量為0.1%時達到最高分90.2，添加量小于0.1%時，山荊子果汁本身的酸味比較單一，導致復合飲料的口感較差，當添加量大于0.1%時，復合飲料的咖啡味和果味也同樣被增大的酸味掩蓋。所以選擇檸檬酸加量0.1%為最優值作為后續研究。

圖3 檸檬酸添加量對復合飲料感官評分的影響

2.2 響應面優化結果分析

2.2.1 響應面試驗在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert.V 8.0.6軟件對原料配比、白砂糖添加量、檸檬酸添加量進行三因素三水平的響應面試驗設計，結果見表3。

表3 響應面實驗設計與結果

對試驗數據進行多元回歸擬合，得到如下二次多項回歸方程：感官評分=90.43-1.11A+ 1.68B-1.15C+1.44AB-1.24AC+2.92BC-5.16A2-5.92B2-4.1 1C2。如回歸方程所示，二次項中A2、B2、C2的系數都為負數，說面響應拋物面開口向下，模型存在極大值，因此可被系統優化，得到最佳的工藝配方。

響應面回歸方差分析結果見表4，試驗模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項誤差不顯著（p=0.264 4＞0.05）。其中R2=0.976 0，adjR2=0.945 2，pred R2=0.757 0，表明實際值與預測值擁有較高擬合度，預測效果較好，模型較合理以及各因素和響應值的函數關系具有可靠性；相互項BC極顯著，說明檸檬酸添加量和白砂糖添加量存在明顯的交互作用；由F值大小可知，影響復合飲料感官評分的各因素主次順序為：白砂糖添加量＞檸檬酸添加量＞原料配比（V/V）。

表4 響應面試驗方差分析結果

2.2.2 因素交互作用分析

原料配比、檸檬酸添加量和白砂糖添加量交互作用的響應面和等高線圖見圖4。

由圖4-a～4-c可知，隨著咖啡和果汁的比例降低、檸檬酸和白砂糖添加量的增加，感官評分都呈現了先上升后下降的趨勢，白砂糖添加量曲面上升幅度稍比檸檬酸幅度大，而咖啡和果汁不同比例曲面上升幅度相對最小，說明三者對飲料感官評分影響確實存在大小不一的順序，即白砂糖添加量＞檸檬酸添加量＞原料配比。由圖4-d～4-f可知，高線圖均呈橢圓形，證明3個因素中兩兩之間存在一定的交互作用，但是只有檸檬酸添加量和白砂糖添加量2個因素存在顯著的交互作用（p＜0.01）。

圖4 各因素交互作用對感官評分影響的三維曲面和等高線

2.2.3 最優工藝的驗證試驗根據感官評分響應面回歸方程分析，得到云南小粒咖啡山荊子復合飲料模型預測工藝：原料配比（V/V）為2.84:1，白糖添加量24.02%和檸檬酸添加量0.10%，其感官評分預測值為86.22分。以此條件進行 3次平行試驗驗證，同一批感官測試者評定，得到平均得分為(85.39±3.25)分，接近模型預測結果，但由于模型優化后的成品感官評分均比中心點組合試驗的感官評分低，因此選擇原料配比（V/V）為2:1，白糖添加量20%和檸檬酸添加量0.10%為最優工藝，平均感官評分為(90.43±1.07)分。

2.3 微生物指標檢測

復合飲料中未檢出大腸菌群和金黃色葡萄球菌群，菌落總數為20 cfu/mL，小于100 cfu/mL，符合GB 7101—2015《食品安全國家標準飲料》的要求。結果表明，復合飲料在加工過程中沒有致病菌產生且微生物菌落達到國家生產飲料要求。

2.4 抗氧化結果分析

烘焙過程中咖啡中的糖和蛋白質、氨基酸等發生反應會產生類黑精、酚類等物質，增強咖啡液的抗氧化能力[30]。麗江山荊子同樣被報道，含有較多的多酚、黃酮類抗氧化能力強的物質[22]。結果表明，滅菌后的復合飲料DPPH自由基清除率達到了(48.31±0.48)%，ABTS+自由基清除能力達到了(16.22±0.76) U/mL，說明加工成型的咖啡山荊子復合飲料具有一定程度的抗氧化活性，具有潛在的對人體健康有益的作用。

3 結論

通過單因素試驗和響應面試驗確定云南小粒咖啡山荊子復合飲料最佳工藝參數為咖啡原液∶山荊子果汁添加量（V/V）=2:1，白砂糖添加量=20%，檸檬酸添加量=0.10%，在此參數下產品感官得分為(90.43±1.07)分。按此工藝所得復合飲料成品微生物指標符合國家相關標準，而且復合飲料成品滅菌后有 DPPH和 ABTS+自由基清除能力，顯示了一定的抗氧化效果，具有進一步開發的價值。