響應面法優化超聲輔助法提取青楷槭葉紅景天苷工藝研究

董艷秋 谷會巖

（1.東北林業大學林學院 黑龍江哈爾濱 150040；2.克拉瑪依綠成農業開發有限責任公司新疆克拉瑪依 834000）

青楷槭（Acer tegmentosumMaxim.）又名青楷子，別名遼東槭，槭樹科落葉喬木[1-2]，國內分布于東北三省、河北和山東地區，國外分布于韓國、朝鮮和俄羅斯遠東地區[3]。研究發現，青楷槭樹皮和樹葉化學成分含有大量的藥用化合物，具有解酒護肝和抗腫消炎的作用，藥用價值巨大[4-5]。

紅景天苷是紅景天根莖的主要有效成分，具有抗氧化、耐高山缺氧功效。由于紅景天多生長在高海拔、較為寒冷地帶，導致紅景天苷資源匱乏，不能滿足市場需求。近年來研究表明，青楷槭葉中含有紅景天苷。青楷槭樹葉生長量大，資源豐富，適合于規模化提取紅景天苷。因此，利用青楷槭葉代替紅景天根莖，獲取紅景天苷，可以改善資源缺乏現象。目前藥理研究證明，紅景天苷對人體內分泌系統及代謝系統具有良好的調理作用，還具有治愈糖尿病、降低細胞毒性、抑菌活性、修復細胞損傷等作用[6-9]。

超聲提取技術具有操作簡單、提取時間短、消耗溶劑低、得率高、無需加熱等特點[10-11]。超聲波提取原理主要為物理過程，利用超聲波產生的強烈震動和空化效應加速植物細胞內物質釋放、擴散并溶入溶劑中，同時可保持被提取物質的結構和生物活性不發生變化。超聲提取也是目前比較常用的方法，與傳統方法相比具有很多優點，已被廣泛應用于食品工業、化學工業、材料工業。本研究利用超聲法，以紅景天苷為指標成分，應用響應面分析法[12-15]研究超聲功率、時間、溫度等因素對紅景天苷得率的關系；同時以紅景天苷得率為響應因子，對青楷槭葉中紅景天苷成分進行提取，對超聲提取過程中的各因素進行優化，為規模生產提供工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料

青楷槭葉2018年7月采集于東北林業大學帽兒山實驗林場，經東北林業大學谷會巖教授鑒定。將野外采集的青楷槭葉自然陰干，用中藥粉碎機粉碎并過180～250 μm篩，取過篩后的粉末作為實驗樣品。對照品紅景天苷（純度97%）購于上海源葉生物科技有限公司，色譜級甲醇購于賽莫非世爾科技（中國）有限公司，分析純乙醇購于天津市天士力化學試劑有限公司，去離子水自制。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助法提取青楷槭葉中的紅景天苷精確稱取一定量的青楷槭葉原料粉末，加入乙醇水溶液中，超聲輔助提取，得到提取液，冷卻至室溫，真空抽濾，取2 mL濾液用0.45 μm一次性濾膜過濾，過膜后的清液采用HPLC檢測。根據標準曲線計算紅景天苷濃度，再計算得率。分別改變乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取功率、提取溫度，其他相同條件不變，得到最佳的提取方法。

1.2.1 .1 乙醇體積分數選擇不同體積分數的乙醇水溶液，乙醇體積分數0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；分別加入10 mL提取溶劑，稱取0.5 g青楷槭原料粉末，超聲功率180 W，超聲溫度50℃，提取20 min，將提取液冷卻后過濾；采用HPLC檢測，計算紅景天苷的得率。

1.2.1 .2 液料比分別精確稱取 0.333、0.400、0.500、0.667、1.000 g的青楷槭原料粉末，加入上一因素最佳濃度的乙醇水溶液（50%體積分數的乙醇10 mL）；超聲功率180 W，超聲溫度50℃，提取 20 min，將提取液冷卻后過濾；采用 HPLC檢測，計算紅景天苷的得率。

1.2.1 .3 超聲溫度選擇最佳液料比及乙醇體積分數，青楷槭原料粉末0.500 g，50%體積分數的乙醇10 mL，分別設置超聲溫度30、40、50、60℃；超聲功率180 W，提取20 min，將提取液冷卻后過濾；采用HPLC檢測，計算紅景天苷的得率。

1.2.1 .4 超聲功率稱取青楷槭原料粉末0.5 g，50%體積分數的乙醇 10 mL，超聲溫度 50℃、超聲時間 20 min，設置超聲功率 72、108、144、180 W，超聲提取后將提取液冷卻過濾；采用HPLC檢測，計算紅景天苷的得率。

1.2.1 .5 超聲時間選擇最佳液料比、乙醇體積分數以及超聲溫度，即青楷槭原料粉末0.500 g，50%體積分數的乙醇 10 mL，超聲溫度 50℃；在超聲功率180 W的條件下，分別超聲提取5、10、20、30、40、50、60 min，將提取液冷卻后過濾；采用HPLC檢測，計算紅景天苷的得率。

1.2.2 高效液相色譜定量測定紅景天苷

1.2.2 .1 定量測定條件采用安捷倫1260高效液相色譜儀測定，紫外二極管陳列檢測器。色譜柱型號為Phenomenex CuroSil-PFP （柱長250 mm、內徑4.6 mm、填料粒徑5 μm）；流動相：超純水加三氟乙酸（A）和甲醇（B）體系；進樣量：10 μL；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；運行時間：60 min；采用甲醇-0.1%三氟乙酸（V∶V=15∶85）等度洗脫。

1.2.2 .2 標準曲線的繪制精密稱取對照品紅景天苷2.5 mg置于25 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容，得每毫升分別含紅景天苷0.1 mg的對照品儲備液，備用；分別精密吸取各對照品儲備液0.5、1、2、4和6 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相定容，配成不同濃度的對照品溶液；依次取 10 μL上述對照品溶液進樣，每個濃度重復 3次；按上述色譜條件測定，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.2.2 .3 樣品中紅景天苷的含量測定將提取液過0.45 μm濾膜，取上清液進行HPLC檢測，每樣重復進樣3次，將峰面積取平均值，代入回歸方程，依式（2）計算紅景天苷的得率。

式中：Y，得率（mg/g）；c，紅景天苷的濃度（mg/mL）；V，提取液體積（mL）；M，原料重量（g）。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

紅景天苷在0～5 mg/mL呈良好的線性關系。線性擬合方程式為：y=183 588x+190.96（1），R2=0.997 0，其中，x為對照品的濃度（mg/mL），Y為1 mg/mL標準液對應的峰面積（圖1）。

圖1 紅景天苷的標準曲線

2.2 單因素的影響

2.2.1 乙醇體積分數的影響實驗結果（圖2）顯示，得率隨乙醇體積分數的增加而逐漸增高，當乙醇體積分數達到50%時，得率最高，但是當乙醇體積分數繼續提高時，得率開始下降。綜合考慮，乙醇體積分數50%為最優提取濃度。

圖2 乙醇體積分數對紅景天苷得率的影響

2.2.2 液料比的影響當固定超聲功率為180 W、提取時間為20 min、處理溫度為50℃，乙醇體積分數為50%，考察液料比對紅景天苷得率的影響。由圖3可以看出，隨著液料比的增大，紅景天苷的得率逐漸增大，當液料比為20∶1[V（mL）∶m（g）]時得率最大，當液料比繼續增大時，紅景天苷的得率趨于平緩。可見當原料和溶劑達到一定量時，接觸面積較為充分，但當原料繼續增加，得率反而下降，也會造成原料浪費。所以選擇20∶1為最優液料比。

圖3 液料比對紅景天苷的影響

2.2.3 超聲溫度的影響固定超聲功率為180 W，乙醇體積分數為 50%，液料比為 20∶1，分別在不同的超聲溫度下提取20 min。從圖4可以看出，隨著超聲溫度的不斷升高，得率明顯增高，當超聲溫度為50℃時得率最高；而當溫度為60℃時，得率就有下降趨勢，原因可能是由于溫度太高提取溶劑有所揮發，也有可能是高溫導致物質分解，因此，選擇50℃作為最佳超聲溫度。

圖4 超聲溫度對紅景天苷的影響

2.2.4 超聲功率的影響固定乙醇體積分數為50%，液料比為 20∶1，提取溫度為 50℃，分別在不同的超聲功率下提取20 min。從圖5可知，超聲功率越大紅景天苷得率越高，當超聲功率為180 W 時得率最高，這是由于此時的超聲的空化作用和機械作用效果最佳。因此選擇180 W作為最佳超聲功率。

圖5 超聲功率對紅景天苷的影響

2.2.5 超聲時間的影響固定乙醇體積分數為50%，液料比為 20∶1，提取溫度為 50℃，在超聲功率180 W條件下提取不同時間。超聲時間對得率的影響如圖6所示。當超聲時間為20 min時，紅景天苷得率最高，隨著超聲時間延長得率趨于平緩，即當原料和提取液的濃度達到平衡動態時紅景天苷的得率才保持恒定。所以選擇20 min為最佳超聲時間。

圖6 超聲時間對紅景天苷的影響

2.3 響應面法優化參數分析

在單因素實驗結果的基礎上，采用 Design-Expert 8.0.6統計分析軟件進行響應面優化，并用Box-Benken組合實驗設計進行數據處理。影響青楷槭葉中紅景天苷提取得率有很多因素，如提取溶劑、液料比等，本實驗選擇超聲溫度（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）3個自變量作為主要考察對象，以紅景天苷得率為響應值設計響應面優化條件，分析本實驗不同因素之間的相互影響，并結合作圖分析，獲得紅景天苷的最佳提取參數。自變量因素和水平見表1。

表1 超聲法提取紅景天苷響的應面分析因素及水平

使用Design-Expert軟件的實驗設計結果（表2）進行方差分析，根據實驗結果（表3）對影響超聲輔助提取青楷槭中紅景天苷得率的因素進行多元回歸擬合，得到紅景天苷得率與超聲提取各因素變量的二次方程模型為：

響應面數據如表2所示，為了降低實驗誤差，本次實驗重復5次。方差分析結果如表3所示，經軟件分析可知，該模型回歸顯著（p＜0.05），失擬項不顯著（p＞0.05），說明上述回歸方程對于本實驗擬合較好。根據回歸方程做響應面圖（圖7～9），分析超聲溫度、超聲功率和超聲時間對青楷槭葉中紅景天苷得率的影響。根據回歸模型進行預測分析，得到最佳超聲優化條件為超聲溫度42℃、超聲功率158 W、超聲時間20 min，此時紅景天苷的得率最大，為0.086 mg/g。

圖7 超聲功率與超聲溫度交互作用對青楷槭葉中紅景天苷得率影響的響應面圖

表2 超聲輔助提取青楷葉中紅景天苷響應面法分析實驗設計結果

表3 響應面擬合回歸方程的方差分析結果

根據響應面優化結果與實驗實際操作方法對參數進行調整，確定提取參數超聲溫度50℃、超聲功率180 W、超聲時間20 min為青楷槭葉中紅景天苷提取的最優參數。

3 結論

采用超聲輔助法提取青楷槭葉中的紅景天苷，結合單因素實驗結果和響應面分析，優化超聲輔助法提取青楷槭葉中紅景天苷的最佳工藝條件。實驗選擇用乙醇溶液作為提取溶劑，測試了乙醇體積分數、液料比、超聲溫度、超聲功率、超聲時間對紅景天苷得率的影響。結果得出，最佳工藝參數為乙醇體積分數50%、液料比為20∶1 [V（mL）∶/m（g）]、超聲溫度為50℃、超聲功率180 W、超聲時間20 min。超聲輔助提取的方法具有操作便捷、用時短、得率高、節能等優點，具有更好的應用價值。

圖8 超聲時間與超聲溫度交互作用對青楷槭葉中紅景天苷得率影響的響應面圖

圖9 超聲時間與超聲功率交互作用對青楷槭葉中紅景天苷得率影響的響應面圖