益生元對益生菌生長代謝的研究

王 新，王 利，王青云，王占東，張居典

（北大荒完達山乳業股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078）

隨著人們生活水平及健康意識的提高，益生菌及益生元越來越多的被用于酸奶發酵。益生菌是一類可定植于腸道，可改善人體微生態平衡，發揮有益作用并且具有生物活性的微生物總稱。益生菌具有改善腸胃、防治腹瀉、增強人體免疫力等功效[1]。益生元不被宿主消化吸收，但可被益生菌利用發酵，從而促進腸道益生菌的繁殖和新陳代謝，是一類可以改善宿主健康的功能物質。目前常用的益生元是功能性低聚糖，一般由2～10個單糖分子組成，具有一定功能特性，屬于寡糖類物質[2-3]。將益生元應用在益生菌酸奶中，具有協同增效的作用。益生元作為益生菌的養料，選擇性刺激益生菌繁殖、促進代謝，賦予益生菌在菌群中的優勢，從而有益宿主健康[4]。本研究選取低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉6種益生元成分，選取復合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）為益生菌，益生元單獨與復合益生菌組合制備益生菌酸奶，通過測定益生菌酸奶的活菌數、胞外多糖產量、產酸能力和風味物質雙乙酰含量等指標，為益生元在益生菌酸奶中的研究與應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低聚果糖；低聚半乳糖；低聚異麥芽糖；低聚木糖；聚葡萄糖；抗性糊精；菊粉；復合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）；液體MRS培養基。

1.2 儀器與設備

天平、pH計、生化培養箱、超凈工作臺、紫外可見分光光度計、離心機、燒杯、稱量勺和溫度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基制備

（1）液體MRS培養基（葡萄糖培養基）的制備。葡萄糖20 g、牛肉浸粉10 g、蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、CH3COONa·3H2O 5 g、檸檬酸三銨2 g、吐溫-80 1 mL、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、Mn-SO4·4H2O 0.05 g，定溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌20 min[5]。

（2）益生元培養基的制備。益生元培養基不添加葡萄糖，其他成分相同，葡萄糖分別用20 g/L低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉替代，添加的益生元均經過0.22 μm水相過濾器過濾。

1.3.2 菌種活化

將冷凍保藏的0.1 g復合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）凍干粉接入活化培養基，振蕩使菌體混合均勻，37 ℃，厭氧條件下振蕩培養24 h。所得菌液按體積分數10%接入新的活化培養基，37 ℃，厭氧條件下培養24 h，制得菌種母液[6]。

1.3.3 乳酸菌活菌數測定

葡萄糖培養基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養基，接種量為1%，置于37 ℃，厭氧培養48 h后測乳酸菌活菌數。乳酸菌菌落總數測定參考《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》 （GB 4789.35—2016），分析發酵過程中益生元對益生菌促增殖能力的影響。

1.3.4 產酸能力測定

葡萄糖培養基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養48 h后，使用pH計對酸度進行測定，分析發酵過程中益生元對益生菌促產酸能力的影響。

1.3.5 胞外多糖產量測定

葡萄糖培養基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養48 h后，取10 mL發酵液，離心處理（4 000 r/min， 15 min），取上清液，用濃度為1 mol/L的NaOH將上清液調整pH至7.5，加入1/10體積的胰蛋白酶液（質量濃度為3 g/L，現配現用），40 ℃水浴酶解 2.5 h。加入1/3體積Sevag液（氯仿∶正丁醇=3∶1，體積比），振搖30 min，離心（4 000 r/min，15 min），除去沉淀，重復1次。加入3～5倍體積的乙醇（體積分數為95%），充分振蕩（多糖呈絮狀沉淀析出），離心（4 000 r/min，15 min），得沉淀。將沉淀用丙酮洗滌脫水2次，干燥得白色粉末即為多糖,采用苯酚-硫酸法測定胞外多糖的質量濃度[7-8]。

1.3.6 雙乙酰產量測定

葡萄糖培養基和益生元（低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、低聚木糖、聚葡萄糖、抗性糊精和菊粉）培養基，接種量為1%，置于37 ℃中，厭氧培養48 h后測定樣本中的雙乙酰含量，選擇鄰苯二胺比色法測定雙乙酰含量，鄰苯二胺和雙乙酰反應合成2,3-二甲喹喔啉，該化合物在335 nm下具有最大吸收峰[9-10]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌活菌數測定

由表1可知，低聚木糖培養基中的乳酸菌活菌數含量最高，為2.2×109CFU/g，然后依次為低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，整體看來與葡萄糖碳源比較，7種益生元均對益生菌有增殖作用。益生元可促進益生菌繁殖，原理是菌體通過分泌相關酶作用于益生元，將其分解為基礎營養物質，從而促進菌體代謝與繁殖[11]。益生菌酸奶的功能性主要取決于活菌數的多少，若要酸奶中的益生菌定植于腸道并發揮作用，攝入量是關鍵。

表1 不同益生元對益生菌活菌數的影響

2.2 產酸能力測定

由圖1可知，低聚木糖培養基pH值最低為3.71，pH值由低到高依次為低聚木糖、低聚半乳糖、低聚果糖、抗性糊精、菊粉、低聚異麥芽糖、聚葡萄糖和葡萄糖，pH越低說明產酸能力越強，從統計結果可以看出，益生元促進益生菌的產酸能力與益生元促進益生菌生長呈正相關。益生菌在益生元的作用下快速繁殖，此過程會產生大量短鏈脂肪酸，可有效降低pH值。在人體腸道中，適宜的pH值有利于維持益生菌的黏附能力，促進其生長和定殖，腸道pH值降低可有效抑制有害菌的繁殖，促進益生菌的繁殖[12]。

圖1 不同益生元對益生菌產酸能力的影響

2.3 胞外多糖產量測定

采用苯酚-硫酸法測定不同培養基胞外多糖產量，如圖2所示。抗性糊精培養基胞外多糖產量最高，然后依次為聚葡萄糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖和葡萄糖。胞外多糖是乳酸菌生長代謝過程中分泌到胞外、具有獨特理化性質和生理功能的一類高分子糖類化合物，屬于微生物次級代謝產物。胞外多糖除了具有增稠、保濕、乳化和穩定等常規理化特性外，還具有抑制癌細胞生長、增強機體免疫力、降低膽固醇以及調節胃腸道等多種生理功能[13-14]。

圖2 不同益生元對益生菌胞外多糖產量的影響

2.4 雙乙酰產量測定

采用鄰苯二胺比色法測定不同培養基雙乙酰產量，如圖3所示。低聚果糖培養基雙乙酰產量最高，然后依次為抗性糊精、低聚半乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、低聚木糖、葡萄糖和聚葡萄糖。在發酵乳制品的風味中,雙乙酰被認為是重要的風味物質,它可以賦予產品以獨特的芳香風味[15]。研究雙乙酰的生成途徑、生成條件及代謝方式，有助于改善發酵乳制品的風味品質。

圖3 不同益生元對益生菌雙乙酰產量的影響

3 結論

益生菌和益生元對維持腸道運轉穩定和人體微生態健康具有重要意義。益生菌與益生元組合使用，具有協同增效的優勢，益生元是益生菌的養料，并且具有選擇刺激益生菌生長、激活益生菌代謝，賦予益生菌優勢性能。根據上述試驗探究得到，益生元的使用可增加益生菌單獨使用的功效，提高其活菌數以及產酸能力，促進其代謝產物的增加。低聚木糖可有效促進復合益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）的增殖，提高其產酸能力；抗性糊精可顯著提高胞外多糖的生成；低聚果糖對代謝過程雙乙酰的生成具有明顯作用。以上研究對產品開發具有一定的指導意義，對后期復合益生元的研究提供了一定基礎。