優(yōu)化頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定蜂蜜揮發(fā)性成分的研究

蔡秋萍，陸大鵬

（湛江市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東湛江 524000）

蜂蜜含有特殊的天然芳香氣味，現(xiàn)大多數(shù)研究均圍繞蜂蜜的非揮發(fā)性成分，如理化性質(zhì)、生物活性成分等，蜂蜜的重要揮發(fā)性成分的鑒定卻鮮少報道。蜂蜜的整體品質(zhì)是多種性質(zhì)成分組合的結(jié)果，因而有必要對蜂蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定。

已知報道中，蜂蜜中揮發(fā)性成分主要包括烴類、醇類、醛類、酯類、酮類、醚類、苯及其衍生物、呋喃、吡喃和萜烯類等多類物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)的含量很低，且對高溫敏感，且之前學(xué)者的前處理方法所選參數(shù)較多，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較復(fù)雜，使用試劑較多，為簡化實(shí)驗(yàn)，探索更加簡易方便，省時快速的前處理方法，探究合理有效的提取方法提取蜂蜜的揮發(fā)性成分很重要[1-7]。本文對頂空固相微萃取法主要條件進(jìn)行優(yōu)化，盡可能全面地提取蜂蜜的揮發(fā)性成分，并能真實(shí)地反映其組成，為后續(xù)的研究分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蜂蜜：荔枝蜜，來自廣東佛山順德。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴振蕩器，SHZ-A，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；電子天平，Qumintix 224-1CN，賽多利斯科學(xué)有限公司；手動固相微萃取裝置，美國Supelco公司；萃取纖維頭：50/30μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）、65 μm PDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）、75 μm CAR/PDMS（碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）、100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷），美國Supelco公司；凝膠色譜-氣質(zhì)聯(lián)用儀，GDC/GCMS-QP2010，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

蜂蜜從冷藏冰箱取出后放至室溫，搖勻至樣品呈均勻液體狀態(tài)，備用。

1.2.2 揮發(fā)性成分提取方法

稱取6 g蜂蜜樣品，置于20 mL頂空瓶中密封，頂空瓶置于55 ℃恒溫水浴鍋中，將裝有65 μm PDMS/DVB萃取頭的手動固相微萃取裝置插入頂空瓶中（萃取頭使用前需進(jìn)行老化），萃取頭不觸碰樣品，55 ℃頂空吸附50 min，250 ℃解吸，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

對1.2.2的揮發(fā)性成分提取方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，對萃取頭、萃取溫度、萃取時間、稱樣量進(jìn)行研究，確定頂空固相微萃取法的前處理參數(shù)。

（1）萃取頭的選擇。4個備選萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS。準(zhǔn)確稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，分別用4種萃取頭在水浴中萃取后，進(jìn)行GC-MS分析。

（2）萃取溫度。稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，設(shè)置萃取溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，分別在上述溫度下萃取，進(jìn)行GC-MS分析。

（3）萃取時間。稱量蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，設(shè)置萃取時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，分別按上述時間進(jìn)行萃取，進(jìn)行GC-MS分析。

（4）萃取樣品量。設(shè)置稱量量為1 g、2 g、4 g、6 g、8 g和12 g，稱取上述重量的蜂蜜樣品于頂空瓶中密封，在50 ℃萃取50 min，進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.4 分析條件

（1）萃取頭的老化。固相微萃取頭在使用前需在氣相色譜的進(jìn)樣口進(jìn)行老化，溫度為250 ℃，時間為1 h。

（2）氣相色譜條件。DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始溫度40 ℃，保持 1 min，3 ℃/min升到100℃，保持10 min，再以 5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.5 mL/min；不分流進(jìn)樣。

（3）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊EI；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描模式：全掃描；掃描質(zhì)子范圍：35～500m/z；EI電子能量： 70 eV。各組分經(jīng)過NIST17.0標(biāo)準(zhǔn)普庫檢索匹配。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總峰面積和數(shù)量作為指標(biāo)參數(shù)，獲得較佳的頂空固相微萃取條件參數(shù)。

2.1 萃取頭的選擇

萃取頭是一根涂有不同色譜固定相或吸附劑的熔融石英纖維，萃取頭是固相微萃取技術(shù)的核心，直接影響著固相微萃取的效果。由表1可以看出，盡管4種萃取頭都適用于揮發(fā)性成分的萃取，但是各自有不同專攻的應(yīng)用范圍，在分析香氣成分以及揮發(fā)性物質(zhì)上有著各自的優(yōu)勢。因此本實(shí)驗(yàn)考察這4種萃取頭在蜂蜜中的應(yīng)用，選取合適的萃取頭。經(jīng)GC-MS分析，結(jié)果如圖1所示。

表1 4種萃取頭的型號和推薦應(yīng)用描述

在相同的萃取條件下，不同萃取頭的萃取效果如圖1（a），萃取蜂蜜中的揮發(fā)性成分總峰面積最大的萃取頭規(guī)格是65 μm PDMS/DVB，萃取總峰面積最小的是50/30 μm DVB/CAR/PDMS規(guī)格的萃取頭，理論上萃取頭吸附材料的填充厚度與吸附容量為正相關(guān)關(guān)系，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸附材料的膜填充量大并不代表萃取的物質(zhì)的量就多，原因在于蜂蜜的揮發(fā)性成分復(fù)雜，而萃取頭的固定相具有選擇性。

圖1 4種萃取頭萃取對總峰面積和峰數(shù)量的影響圖

結(jié)合表1的萃取頭推薦應(yīng)用描述，可知蜂蜜的揮發(fā)性物質(zhì)中氣體分子和小分子量化合物的比例較小，MW 30～275型萃取頭不足以涵蓋蜂蜜揮發(fā)性成分的范圍，更多的物質(zhì)的量應(yīng)該在MW 275以上。

僅從總峰面積來評價萃取頭的吸附效果不夠全面，總峰面積能表明萃取頭吸附是否充分，可能情況是對蜂蜜中的揮發(fā)性單一成分或者其中的幾種成分有較充分的吸收，但不能體現(xiàn)吸附的揮發(fā)性成分的種類是否齊全，所以需要評價峰數(shù)量指標(biāo)。從圖 1（b）中可以看出，萃取蜂蜜揮發(fā)性成分峰數(shù)量較多的萃取頭規(guī)格是65 μm PDMS/DVB，峰數(shù)量達(dá)到84個，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS，峰數(shù)量達(dá)到60個，而75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS吸附的峰數(shù)量相對較少，僅為32個和41個。峰數(shù)量越多表明吸附的揮發(fā)性成分種類越多，吸附的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量與萃取頭的固定相有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取頭含有DVB這種固定相材料更有利于提取蜂蜜中的揮發(fā)性成分。

結(jié)合總峰面積和峰數(shù)量綜合評價萃取頭，4種萃取頭規(guī)格中適合蜂蜜中揮發(fā)性成分分析的為65 μm PDMS/DVB。

2.2 萃取溫度的優(yōu)化

在本方法中，蜂蜜沒經(jīng)過復(fù)雜的預(yù)處理，或是溶劑萃取，因此溫度對萃取效率的影響尤為重要。選擇合適的溫度是確保最佳萃取速度和靈敏度的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對總峰面積和峰數(shù)量的影響圖

從圖2（a）的結(jié)果顯示，蜂蜜在同等的萃取條件下，隨著溫度的升高，萃取物質(zhì)的總峰面積整體呈現(xiàn)遞增趨勢，這與隨著溫度的上升有關(guān)，分析物熱運(yùn)動加強(qiáng)，揮發(fā)性成分在頂空空間中分配系數(shù)變大，而且可能產(chǎn)生新的物質(zhì)，所以總峰面積總體是遞增的趨勢。而圖2（b）中萃取溫度對峰數(shù)量的影響是正向的，在50 ℃時峰數(shù)量達(dá)94個，50～70 ℃的峰數(shù)量基本一致。綜合評價總峰面積和峰數(shù)量，需要找到一個合適的溫度既能真實(shí)充分體現(xiàn)蜂蜜揮發(fā)性物質(zhì)的種類，有足夠的物質(zhì)的量進(jìn)行分析，又盡量不產(chǎn)生新的物質(zhì)，在50～60 ℃選擇，本實(shí)驗(yàn)考慮使用60 ℃為較好的萃取溫度。

2.3 萃取時間的優(yōu)化

頂空固相微萃取的萃取過程是一個動力學(xué)平衡的過程，選擇合適的時間十分重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取時間對總峰面積和峰數(shù)量的影響圖

圖3 中是萃取時間對蜂蜜萃取的影響，可以看到隨著時間的延長，蜂蜜萃取的總峰面積和峰數(shù)量都呈現(xiàn)著遞增的趨勢，且在40～70 min，總峰面積和峰數(shù)量趨于相同，在60 min達(dá)到總峰面積最高和峰數(shù)量最多。基于在頂空微萃取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)已得到較佳萃取頭、萃取溫度的前提下設(shè)計(jì)了萃取時間的實(shí)驗(yàn)，為得到較好的萃取效果，在確保萃取效果的情況下，應(yīng)選擇較短的分析時間，本實(shí)驗(yàn)所選擇的萃取時間為60 min。

2.4 萃取樣品量的優(yōu)化

在頂空固相微萃取中，頂空空間體積直接影響著頂空吸附的效率，頂空空間體積與樣品取樣量及頂空裝置的比例有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 稱樣量對總峰面積和峰數(shù)量的影響圖

從圖4可以看出，隨著取樣量的遞增，總峰面積和峰數(shù)量的變化規(guī)律是一致的，均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。在較少取樣量時（1 g、2 g、4 g），總峰面積和峰數(shù)量變化不明顯且均在較低水平，樣品量為6 g和8 g時，總峰面積和峰數(shù)量均達(dá)到較高水平，之后隨著取樣量遞增（10 g、12 g），萃取效果顯著變差。因此，取樣量8 g時樣品的頂空空間體積與樣品量的比例較合適，本實(shí)驗(yàn)選擇8 g為蜂蜜的取樣量。

3 結(jié)論

對頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總峰面積和峰數(shù)量為指標(biāo)進(jìn)行比較，得到頂空固相微萃取的最佳參數(shù)為蜂蜜稱樣量為8 g，使用65 μm PDMS/DVB的萃取頭，在60 ℃下萃取60 min，且本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單、快速、環(huán)保，能真實(shí)有效地反映蜂蜜中的揮發(fā)性成分的含量情況。本研究為蜂蜜揮發(fā)性成分的研究提供一定的理論依據(jù)。