一種分離培養及鑒定小鼠牙齦間充質干細胞的方法

陳麗玲 徐振健 徐安平

間充質干細胞（MSC）具有自我更新、多能分化和免疫調節的作用。近年研究顯示，MSC 可在包括變應性結膜炎、變應性鼻炎、急性青光眼、阿爾茨海默病和1 型糖尿病等多種疾病中發揮治療作用。MSC 可以從不同的組織中分離出來，包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組織和人的牙齦。牙齦MSC（GMSC）是一種從牙齦組織中獲得的MSC 亞群，2009 年Zhang 等首次從人牙齦組織中分離出GMSC，并證實了其表型及功能活性。與其他MSC 類似，GMSC 也具有抑制炎癥和調節免疫反應的作用。小鼠和人源化動物模型研究顯示，GMSC 能夠通過減少效應性T 淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、破骨細胞和增加調節性T 淋巴細胞等治療包括類風濕關節炎、1 型糖尿病、SLE、動脈粥樣硬化等多種疾病。既往文獻提及的小鼠GMSC 的提取方法需使用多種酶及復雜的培養基等。本研究以C57BL/6 小鼠進行實驗，旨在建立更為簡便、高效的GMSC 體外提取及培養體系，現報道如下。

材料與方法

一、動 物

SPF 級C57BL/6 小鼠5 只，雌雄不限，8～10周齡，體質量15～20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心。實驗過程中嚴格遵循減少、替代、優化的倫理規范操作，做到充分考慮動物的利益，善待動物，防止或減少動物的應激、痛苦和傷害，尊重動物生命，采取痛苦最少的方法處置動物。

二、主要試劑

包括：α-MEM 培養基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清（FBS），均購自美國Gibco 公司；Ⅳ型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、人胰島素、油紅O 染液，均購自美國Sigma 公司；細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8 法）購自美國APExBio 公司；結晶紫染液、茜素紅染液，均購自上海碧云天生物技術有限公司；抗小鼠流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，均購自美國BD 公司。

三、培養液配制

原代細胞培養液為α-MEM 培養基+20%FBS。完全培養液為α-MEM+10%FBS。成脂誘導液為α-MEM 培養基+10%FBS+200 μmol/L 吲哚美辛+10 mg/L 胰島素+1 μmol/L 地塞米松+500 μmol/L IBMX。成骨誘導液為α-MEM+10%FBS+10 nmol/L地塞米松+50 mg/L 抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。

四、實驗方法

1. 小鼠GMSC 的分離培養

處死C57BL/6 小鼠，取小鼠下頜骨，清除多余皮膚及肌肉組織，用含有5%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗下頜骨多次。用注射器針頭輕輕分離磨牙區牙齦。收集分離到的組織于培養皿中，加入1 mg/L Ⅳ型膠原酶，于37 ℃中消化30 min，加入含有 FBS 的α-MEM 終止消化，離心，棄上清。將組織鋪于6 孔板中，每孔加1 mL 含20%FBS 的α-MEM，置于37℃、5%CO培養箱中培養。待2～3 d 后細胞爬出，換液把剩余組織塊洗出，每孔加2 mL 20%FBS 的α-MEM，3 d 換1 次液。細胞長滿板底80%后傳代，傳代后更換為含10%FBS的完全培養液繼續培養。

2. 小鼠GMSC 的增殖能力檢測

按細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（CCK-8法）說明書進行操作，連續8 d 在同一時間使用酶標儀測量 450 nm 處的吸光度，根據結果繪制GMSC 生長曲線。

3. 小鼠GMSC 的表面標志物流式細胞術檢測

將第2 代 GMSC（約1×10個細胞）細胞懸液用PBS 洗滌2 次，用100 μL PBS 重懸后分別加入 流 式 抗 體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，4℃避光孵育20 min 后，PBS 洗滌3次，流式細胞儀檢測上述細胞表面標志物的表達。

4. 小鼠GMSC 的多向分化潛能誘導

成脂誘導分化：取第2 代GMSC 接種于6 孔板，每孔約3×10個細胞，待細胞鋪滿板底70%，更換培養液為成脂誘導液，每隔3 d 換1 次液。誘導21 d 后，PBS 洗滌細胞1 次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2 次后油紅O 染液染色20 min，蒸餾水清洗3 次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

成骨誘導分化：取第2 代GMSC 接種于6 孔板，每孔約3×10個細胞，待細胞鋪滿板底70%，更換為成骨誘導液，每隔3 d 換1 次液。誘導28 d 后，PBS 洗滌細胞1 次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2 次后茜素紅染液染色30 min，蒸餾水清洗3 次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

五、統計學處理

應用GraphPad Prism 8 軟件進行數據分析。數據均符合正態分布，以 表示，組間比較采用t 檢驗，多個時間點的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠GMSC 的分離培養結果

培養2～3 d 后，普通光學倒置顯微鏡下可見原代細胞從組織爬出，貼壁生長，細胞呈長梭狀（圖1A）。可見原代細胞培養至10～14 d 時細胞鋪滿皿底80%（圖1B、C），可進行傳代培養。

圖1 小鼠GMSC 的分離培養與形態（普通光學倒置顯微鏡）

二、小鼠GMSC 的增殖能力檢測結果

CCK-8 法結果顯示，GMSC 在第3～4 日增長最快，在第5～8 日增長變得緩慢，出現平臺期。普通光學倒置顯微鏡下可見GMSC 在第3～4 日數量增長明顯，在第5～8 日數量逐漸到達最大值，并進入平臺期。各時間點的變化組間比較差異有統計學意義（F = 339.90，P ＜ 0.001）， 其中第0～2 日、第5～8 日的相鄰時間點比較差異無統計學意義（P均＞ 0.05），第2～5 日相鄰時間點比較差異均有統計學意義（P 均＜ 0.05），見圖2。

圖2 小鼠GMSC 的增殖能力檢測結果

三、小鼠GMSC 的細胞表面標志物流式細胞術檢測結果

小鼠GMSC 高表達CD29、CD44、CD90、CD105，最高的表達率達90%及以上，CD73 最高表達率高于70%，CD39 最高表達率為26.3%，同時結果顯示所提取細胞幾乎不表達CD34、CD45，表達率均低于5%，說明所提取的細胞純度較高。以小鼠口腔黏膜上皮細胞為對照細胞，可見GMSC 的CD29（t = 2.686，P = 0.036）、CD44（t = 22.582，P ＜0.001）、CD73（t = 3.183，P = 0.019）、CD90（t =62.944，P ＜ 0.001）、CD105（t = 8.590，P ＜ 0.001）、CD39（t= 5.799，P ＜ 0.001）的表達均高于對照細胞，兩者CD34（t = 1.572，P = 0.140）、CD45（t =-1.643，P = 0.151）表達相似，見圖3。

圖3 小鼠GMSC 的細胞表面標志物流式細胞術檢測結果

四、小鼠GMSC 的成脂誘導及鑒定結果

小鼠GMSC 經成脂誘導液培養21 d 后，分化為脂肪細胞并分泌出脂滴，經油紅O 染液染色后，在光學顯微鏡下可見葡萄串狀紅色脂滴形成，見圖4。

圖4 GMSC 成脂誘導分化的鑒定（油紅O 染液染色）

五、小鼠GMSC 的成骨誘導及鑒定結果

小鼠GMSC 經成骨誘導液培養后，細胞逐漸從長紡錘形變為多邊形，并呈多層覆蓋生長，可見陸續出現小的鈣化。成骨誘導28 d 后，小鼠GMSC 經茜素紅染液染色后可見紅褐色鈣化結節，見圖5。

圖5 GMSC 成骨誘導分化的鑒定（茜素紅染液染色）

討 論

近年來，GMSC 在自身免疫性和炎癥性疾病中的抗炎和免疫調節作用越來越受到重視。與其他組織來源的MSC 相比，GMSC 具有易于分離、便于獲取、增殖快、不具致瘤性、同源性好、免疫調節作用及再生功能強于其他MSC 等優點。

目前，小鼠等動物GMSC 的提取方法為組織消化法或組織塊法：組織消化法使用膠原酶和分離酶消化分離的組織塊，再通過過濾器獲得單細胞懸液進行種板，操作步驟繁雜，且多種酶的消化易對原代GMSC 造成損傷，導致細胞提前分化失去其生物學特性；組織塊法則將沖洗無菌的組織塊直接種板，通過倒立培養瓶的方法獲取原代細胞，該法提取細胞數量少、效率低且成功率不穩定。

本研究將2 種提取原代GMSC 的方法相結合并加以改良，對分離的牙齦組織僅用Ⅳ型膠原酶消化半小時，然后把消化后的牙齦組織直接種板，2～3 d 后可見細胞爬出。由此可見該改良方法具有以下優點：①步驟過程簡單、易操作；②僅用一種消化酶，減短了消化時間，不僅減少了消化酶對原代細胞的損傷，而且節約了試劑成本；③經膠原酶處理的牙齦組織變軟后再進行種板，更有利于種板后GMSC 從組織中爬出，短時間內有較高的細胞獲得率，節約時間成本，同時通過換液、傳代可進一步純化細胞；④培養液成分更為簡單。與組織消化法及組織塊法相比，新的提取GMSC方法更為簡便、易行，見表1。

表1 小鼠GMSC 的3 種分離培養方法比較

本研究中小鼠GMSC 生長曲線從一定程度上可反映GMSC 的增殖規律，第3～4 日增殖活躍，第5 日始增殖進入平臺期，第7～8 日由于培養時間過長細胞生長過密，細胞開始出現凋亡，數量有少許下降。本研究所提取的細胞高表達CD29、CD44、CD90、CD105，最高表達率均高于90%，CD73 最高表達率高于70%，基本不表達造血細胞的細胞表面標志物CD34、CD45，最高表達率均低于5%，符合GMSC 細胞標志物特性，同時提示所取取的細胞純度較高。多向分化誘導實驗中，小鼠GMSC 在各自特定誘導條件下成功分化成對應組織，證實了GMSC的多向分化功能。本研究表明，改良法提取的GMSC 具有快速增殖的優點，同時通過該法所分離的細胞有較高的純度，且能表現多向分化的干細胞特性，因此該法提取GMSC 是可行的。

對GMSC 的相關研究表明，GMSC 在倫理學、獲取方法和分化潛能等方面具有明顯優勢，被認為是一種較好的MSC 來源，在細胞治療、再生醫學等方面具有重要的研究意義。本研究的動物GMSC 提取技術的研究與改良有助于促進各類疾病動物模型GMSC 的自體移植的實現，有利于深入研究GMSC 對疾病治療作用的可能機制。