三維CT定量及定性參數與純磨玻璃結節樣肺腺癌TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表達的相關性研究

許雙燕，馮濤， 曹宏偉， 曹振東

肺癌在我國的發病率和病死率呈逐年升高趨勢[1,2]，近年來，隨著人們對健康的重視程度逐漸增高及低劑量CT的廣泛開展，肺磨玻璃結節(ground-glass opacity nodules，GGN)的檢出率也不斷升高[3]。肺腺癌是肺癌病理類型中最常見的一種，相關研究顯示，GGN術后病理學檢測多表現為腺癌，并遵守一種循序漸進的惡變發展方式[4]。根據GGN內是否含有實性成分，分為純磨玻璃密度結節(pure ground-glass nodule，pGGN)和混雜磨玻璃密度結節(mixed ground-glass nodule，mGGN)。由于pGGN不含有實性成分，所以相較于mGGN，對于其惡性程度的評價具有一定難度。多項研究表明，基于計算機輔助診斷系統的薄層三維CT定量及定性參數在鑒別診斷pGGN的侵襲性中具有重要價值[5]。隨著分子生物學的迅速發展，近年來許多與肺腺癌病理和預后有關的分子標志物成為眾多學者關注的重點，如拓撲異構酶2α(Topoisomerase II Alpha，TOP2A)[6]、腦酸溶性蛋白1(brain acid soluble protein 1，BASP1)[7]和序列相似家族72成員(sequence similarity 72，FAM72)[8]。因此，通過對這些分子標志物的表達進行研究，有助于患者預后評估及臨床治療方案的制定。然而，目前需通過獲得活體組織標本，結合病理診斷結果才能完成對這些分子標志物的檢測，具有一定的滯后性和有創性。影像學檢查具有方便、快速、無創等優點[9]，然而目前還未有研究探討三維CT定量及定性參數在預測TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表達中的作用。本研究旨在通過探究pGGN樣肺腺癌的三維CT定量及定性參數與TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表達間的相關性，以期為術前非侵襲性預測肺腺癌預后以及制定疾病治療方案提供影像學思路。

材料與方法

1.病例資料

納入2019年1月-2021年1月在本院初診并行手術治療的肺腺癌患者作為研究對象。病例納入標準：①術前薄層CT掃描結果表現為pGGN，且為單個結節；②術前未行放化療或其他抗腫瘤治療；③經兩位以上病理學專家確診為肺腺癌；④未發生縱隔淋巴結轉移或遠處器官轉移。病例排除標準：①薄層CT掃描結果顯示實性結節；②合并其他部位惡性腫瘤；③合并其他肺部疾患或有胸廓手術史；④臨床病理學或影像學資料不完整。最終，本研究共納入164例患者，其中男95例，女69例，年齡范圍27～81歲，平均年齡(59.41±7.21)歲。本研究獲得了醫院倫理委員會的支持，所有患者均自愿參與研究并簽署了書面知情同意書。

2.檢查方法

采用德國Siemens SOMATOM Definition AS+螺旋CT機對患者進行胸部CT掃描。胸部CT掃描范圍為肺尖至膈底，掃描參數：管電壓120 kV，管電流100～200 mA，矩陣512×512，螺距1.2，層厚7 mm，標準重建層厚1 mm。將所有重建圖像傳至Siemens后處理工作站(SyngoMMWP VE40A)，應用Siemens三維后處理MM Reading及分析軟件Oncology對發現的結節進行處理。在 Oncology上找到相應結節并在結節出現的每層橫斷面中勾畫結節的邊界，隨后由軟件自動獲取以下定量參數：結節最長徑、體積和平均CT值。定量參數的最終值取2位肺結節診斷經驗豐富的影像學醫師測量的平均值。此外，在MM Reading上采用多平面重建、最大密度投影、容積再現技術觀察結節的形態，得到定性指標，包括分葉征、空泡征、血管集束征、充氣支氣管征、胸膜牽拉征和瘤肺界面模糊征等。由2位醫師共同閱片評估，當結果出現不一致時，通過商討達成一致。

3.免疫組化方法及判定標準

取術后病理組織標本，采用免疫組織化學檢測TOP2A、BASP1、FAM72蛋白的表達水平，試劑盒由福州邁新生物技術開發有限公司提供。TOP2A主要定位于細胞核，BASP1主要定位于細胞質，FAM72主要定位于細胞質。陽性細胞呈棕黃色，染色程度越深則得分越高，無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；染色細胞所占比例越高得分越高，陰性計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分，最終分值為染色程度得分與染色細胞比例得分相乘得到，<3分認為是低表達水平，≥3分認為高表達水平。

4.統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。定量資料以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗；定性資料以頻數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。對單因素分析結果中有統計學意義的因素進一步行多因素二元Logistic分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.病理及免疫組化結果

164例pGGN患者中，浸潤性腺癌62例，微浸潤腺癌68例，原位腺癌21例，不典型腺瘤樣增生13例。其中TOP2A高表達94例(57.3%)，低表達70例(42.7%)；BASP1高表達88例(53.7%)，低表達76例(46.3%)；FAM72高表達96例(58.5%)，低表達68例(41.5%)。

2.TOP2A、BASP1、FAM72蛋白不同表達水平的三維CT指標比較

TOP2A的表達水平與三維CT定量指標中的結節最長徑、結節體積和結節平均CT值均顯著相關，與定性指標中的分葉征、血管集束征和充氣支氣管征顯著關聯。TOP2A高表達者的結節最長徑、結節體積均顯著高于低表達者，結節平均CT值與低表達者相比顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；TOP2A高表達者中出現分葉征、血管集束征和充氣支氣管征的比例與低表達者相比顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 TOP2A蛋白不同表達水平間的三維CT指標比較

BASP1的表達水平與三維CT定量指標中的結節最長徑和結節平均CT值相關，與定性指標中的分葉征、血管集束征、充氣支氣管征和胸膜牽拉征相關。BASP1高表達者的結節最長徑顯著高于低表達者，結節平均CT值與低表達者相比顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；BASP1高表達者中出現分葉征、血管集束征、充氣支氣管征和胸膜牽拉征的比例與低表達者相比顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2 BASP1蛋白不同表達水平間的三維CT指標比較

FAM72的表達水平與三維CT定量指標中的結節平均CT值相關，與定性指標中的血管集束征、充氣支氣管征和胸膜牽拉征相關。FAM72高表達者的結節平均CT值與低表達者相比顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；FAM72高表達者中出現血管集束征、充氣支氣管征和胸膜牽拉征的比例顯著高于低表達者，差異有統計學意義(P<0.05，表3)。

表3 FAM72蛋白不同表達水平間的三維CT指標比較

3.TOP2A、BASP1、FAM72蛋白不同表達水平的多因素二元Logistic回歸分析

對三維CT各定性指標(分葉征、空泡征、血管集束征、充氣支氣管征、胸膜牽拉征)進行變量賦值(無賦值為0，有賦值為1)。分別以TOP2A、BASP1、FAM72蛋白的表達水平為因變量(低表達賦值為0,高表達賦值為1)，以各自單因素分析結果中有統計學意義的變量作為自變量進行多因素二元Logistic分析。結果顯示，結節最長徑、結節平均CT值和血管集束征是肺腺癌TOP2A高表達的獨立預測因子(P<0.05)，結節最長徑、結節平均CT值、血管集束征和胸膜牽拉征是BASP1高表達的獨立預測因子(P<0.05)，結節平均CT值、血管集束征和充氣支氣管征是肺腺癌FAM72高表達的獨立預測因子(P<0.05，表4、圖1～3)。

圖1 浸潤性肺腺癌患者，女，63歲，TOP2A高表達，左肺上葉結節(箭)，MSCT表現為分葉征、毛刺征。結節大小約2.7cm×2.3cm，CT值約-560HU。 圖2 浸潤性肺腺癌患者，男，52歲，BASP1高表達，左肺下葉結節(箭)，MSCT表現為分葉征、毛刺征。結節大小約1.4cm×1.9cm，CT值約-320HU。 圖3 浸潤性肺腺癌患者，女，68歲，FAM72高表達，右肺上葉結節(箭)，MSCT表現為分葉征、毛刺征、胸膜凹陷征。結節大小約3.1cm×2.2cm，CT值約-320HU。

表4 Logistic回歸分析結果

4.三維CT定量指標對TOP2A、BASP1和FAM72表達的預測價值分析

對多因素Logistic回歸中有統計學意義的CT定量指標進行預后分子標志物的ROC曲線分析，結果顯示均有統計學意義(P<0.05，表5、圖4)。

圖4 a)三維CT定量指標預測TOP2A表達的ROC曲線；b)三維CT定量指標預測BASP1表達的ROC曲線；c)三維CT定量指標預測FAM72表達的ROC曲線。

表5 三維CT定量指標對TOP2A、BASP1和FAM72表達的預測價值

討 論

近年來，肺癌在我國的發病率居高不下，肺癌的早發現、早診斷及早治療對提高患者生存率，改善患者預后具有重要意義[10]。迄今為止，肺腺癌的發生、發展機制還未完全明確，近年來，隨著分子生物學的迅速發展，許多與肺腺癌病理和預后有關的分子標志物受到了眾多研究者的關注[11]。TOP2A通過放松正負DNA 超螺旋來調節拓撲結構，并解決DNA復制和轉錄過程中的染色體凝聚和染色單體分離，此外，TOP2A在快速分裂的細胞中大量積累，與多種癌癥的細胞增殖有關。最近的一項研究顯示，TOP2A在肺腺癌組織中表達顯著上升，可預測肺腺癌的惡性進展，并且預示著患者預后不良[6]。BASP1是一種膜結合蛋白，相關研究表明BASP1可促進肺腺癌的發生和發展，并且是肺腺癌的潛在治療靶點，與疾病的預后不良有關[7]。FAM72是一種神經干細胞特異性蛋白質，可能導致有絲分裂后神經元死亡，并可能促進神經元組織以外其他組織癌癥的發生和發展。相關研究顯示，FAM72肺腺癌細胞的分裂、增殖和分化有關， FAM72水平升高可影響肺腺癌的預后[8]。因此，TOP2A、BASP1、FAM72都是與肺腺癌預后有關的分子標志物，術前通過無創性的三維CT檢查，探討CT征象及定量參數與pGGN樣肺腺癌預后分子標志物表達間的相關性，有助于術前無創性評估肺腺癌預后及選擇臨床治療方案。

本研究單因素分析結果顯示，TOP2A的表達水平與結節最長徑、結節體積、結節平均CT值、分葉征、血管集束征和充氣支氣管征相關；BASP1的表達水平與結節最長徑、結節平均CT值、分葉征、血管集束征、充氣支氣管征和胸膜牽拉征相關；FAM72的表達水平與結節平均CT值、血管集束征、充氣支氣管征和胸膜牽拉征相關。進一步的多因素Logistic分析結果顯示，結節最長徑、結節平均CT值和血管集束征是肺腺癌TOP2A高表達的獨立預測因子，結節最長徑、結節平均CT值、血管集束征和胸膜牽拉征是BASP1高表達的獨立預測因子，結節平均CT值、血管集束征和充氣支氣管征是肺腺癌FAM72高表達的獨立預測因子。以上結果表明，三維CT定量和定性參數對肺腺癌預后分子標志物的預測具有重要意義。

之前的研究表明，pGGN的最長徑和平均CT值是肺腺癌浸潤性的獨立預測因素，而肺腺癌的浸潤程度越嚴重，其預后可能越差[12]。傳統的二維平均CT值只能單一反映某個層面而難以顯示出整個病灶的情況，本研究中采用的三維平均CT值能更全面反映病灶整體情況，并減少偏差。之前的研究顯示，血管集束征與pGGN的浸潤性有關，pGGN的浸潤性越強，癌細胞釋放的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等多種刺激因子促血管生成作用則越強，引起血管構形改變，最終導致血管壁因牽拉而出現血管集束現象[13]。相關研究還顯示，VEGF等刺激因子與肺腺癌的臨床分期及惡性程度有關，VEGF表達升高預示著患者預后不良[13]，因此血管集束征的出現可能與預后分子標志物的高表達有關。胸膜牽拉征的主要病理基礎是瘤內纖維化，相對而言，新發腫瘤其病灶內的血管結構缺乏完整性，且血管內皮的間隙較大，因此血液中的纖維蛋白原更容易滲入組織間隙中，從而促進纖維母細胞的生成；此外，惡性腫瘤細胞增殖旺盛，組織內缺氧會導致腫瘤病灶產生纖維化收縮，從而使得牽拉征的發生概率進一步增高[14]。陳威等[15]的研究也顯示胸膜牽拉征是預測GGN浸潤性的一個重要指標。充氣支氣管征的發生機理是肺內炎癥滲出導致的肺實變改變，周圍的肺組織含氣量減少，而病變的支氣管內含有氣體，形成對照。充氣支氣管征與肺腺癌的浸潤程度密切相關，pGGN的惡性程度越高，成纖維細胞對結節內部纖維化反應的刺激越強，會導致支氣管被牽拉擴張，同時支氣管壁因被腫瘤細胞侵犯而走行僵硬、扭曲。之前的研究表明，肺腺癌組織中FAM72表達升高與結節內部的炎癥和纖維化有關[8]，因此充氣支氣管征的出現可能預示著FAM72的高表達。此外，筆者采用ROC曲線分析了三維CT定量指標對TOP2A、BASP1和FAM72表達的預測價值，結果顯示均有統計學意義，結節最長徑、結節平均CT值預測TOP2A高表達的敏感度和特異度分別為70.2%、84.3%和72.3%、78.6%，結節最長徑、結節平均CT值預測BASP1高表達的敏感度和特異度分別為75.0%、78.9%和63.6%、68.4%，結節平均CT值預測FAM72高表達的敏感度和特異度分別為75.0%和73.5%，因此僅應用三維CT定量指標預測預后分子標志物表達狀態的效能中等。

綜上所述，三維CT定量及定性參數與純磨玻璃結節樣肺腺癌TOP2A、BASP1、FAM72蛋白表達水平相關，有助于預測患者預后和制定臨床治療方案。