MSCT灌注參數(shù)與結(jié)直腸癌GRHL3、SEMA6B表達水平的相關(guān)性研究

王華， 容練， 陶俞安

結(jié)直腸癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤，位列中國癌癥死亡原因第5位，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制非常復雜，目前還未完全明確。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，許多學者密切關(guān)注與結(jié)直腸癌病理特征及預后有關(guān)的分子標志物[2,3]。果蠅頭狀因子3(Grainyhead-like 3，GRHL3)是轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，最近的研究顯示，GRHL3表達水平上調(diào)時可促進結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移，并且與患者的不良預后有關(guān)[4,5]。信號素6b(Semaphorin 6b，SEMA6B)是軸導信號家族中的一個成員分子，已被證實在多種癌癥中表達異常，相關(guān)研究顯示SEMA6B在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著上調(diào)，并且SEMA6B高表達與結(jié)直腸癌患者不良預后和腫瘤免疫抑制微環(huán)境相關(guān)[6]。因此，GRHL3和SEMA6B均是結(jié)直腸癌患者的有效預后標志物。然而，目前對這些分子標志物的檢測都是有創(chuàng)性的，診斷需通過活體組織標本結(jié)合病理結(jié)果才能得到。MSCT灌注成像技術(shù)可以清晰顯示癌灶內(nèi)的血管和血液流動狀態(tài)，已被證實在結(jié)直腸癌的診斷及臨床病理分期中具有重要價值[7,8]。然而，目前還未有研究探討結(jié)直腸癌MSCT灌注參數(shù)與GRHL3、SEMA6B這些預后分子標志物的相關(guān)性。因此，本研究旨在通過比較不同GRHL3、SEMA6B表達水平結(jié)直腸癌患者的MSCT灌注參數(shù)，以期術(shù)前無創(chuàng)性對結(jié)直腸癌預后進行評估，從而為選擇疾病的最佳治療策略提供影像學依據(jù)。

材料與方法

1.病例資料

前瞻性選擇2019年9月-2021年9月于本院就診并行手術(shù)治療的74例結(jié)直腸癌患者作為研究對象，其中男41例，女33例，平均年齡(61.04±4.26)歲，結(jié)腸癌28例，直腸癌46例。術(shù)中取癌組織和遠離癌組織的正常結(jié)直腸黏膜組織。病例納入標準：①年齡18～70周歲；②經(jīng)病理確診為結(jié)直腸腺癌；③未進行過抗腫瘤治療；④影像學和臨床、病理資料完整。病例排除標準：①合并其他部位腫瘤；②患有嚴重心、腦、肝、腎疾病；③合并其他消化道疾病，如急慢性胃腸炎、十二指腸潰瘍、炎癥性腸病等；④存在嚴重的水電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂。所有患者及其家屬均對本研究知情同意，并簽署了知情同意書。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準。

2.研究方法

MSCT檢查及圖像分析：受檢者檢查前禁食6 h，使腸道清空；檢查前10～15 min肌注鹽酸消旋山崀菪堿10 mg；經(jīng)Foley's導尿管將溫生理鹽水從肛門注入患者腸管，直至患者略感不適。受檢者取仰臥位，采用64層CT掃描機對患者腹盆部進行CT平掃，選擇癌灶最大層面進行灌注，以6 mL/s流率將50 mL碘普羅胺注射液經(jīng)患者肘前靜脈注入，延遲10 s后進行灌注掃描，持續(xù)時間60 s，管電壓為100 kV，管電流為100 mA。將掃描圖像上傳至工作站，由兩位經(jīng)驗豐富的影像醫(yī)師應用程序處理軟件分析掃描圖像，若出現(xiàn)意見分歧，經(jīng)商討后達成一致。選擇感興趣區(qū)進行定量分析，注意避開血管及腫瘤邊緣區(qū)、腫瘤壞死區(qū)；由工作站中的軟件計算灌注參數(shù)，包括血容量(blood volume，BV)、血流量(blood flow，BF)、達峰時間(time to peak，TTP)和表面通透性(permeability surface，PS)，記錄兩位醫(yī)師得到的參數(shù)平均值。

免疫組化檢查及判定標準:術(shù)中取患者腫瘤組織和癌旁正常組織，組織離體后立即置入-196℃液氮中保存待用。采用免疫組織化學法檢測組織中的微血管密度(microvessel density，MVD)值及GRHL3、SEMA6B表達水平。采用雙盲法對檢測結(jié)果進行評估，若出現(xiàn)分歧，則與第3位病理科醫(yī)師商討后確定最終結(jié)果。MVD值判定：以被CD34染色成孤立的棕黃色內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞團認為1個微血管，先以低倍鏡選擇微血管數(shù)量最多區(qū)域后，轉(zhuǎn)換至高倍鏡下，隨機挑選10 個視野，所得均值即為MVD值。GRHL3、SEMA6B表達水平判定：①顯色強度計分：無著色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分；②陽性細胞百分比計分：≤5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，>75%計為4分，取顯色強度計分與陽性細胞百分比計分的乘積作為最終得分，分數(shù)>3分認為陽性表達，≤3分認為陰性表達。

3.統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗；分類資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。兩符合正態(tài)分布的定量變量間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。采用受試者工作特征 (receiver operating characteristic,ROC)曲線分析MSCT灌注參數(shù)對分子標志物表達水平的預測效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織GRHL3、SEMA6B表達水平的比較

結(jié)直腸癌組織中的GRHL3陽性表達者比例(70.27%)顯著高于癌旁正常組織(33.78%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；結(jié)直腸癌組織中的SEMA6B陽性表達者比例(63.51%)高于癌旁正常組織(31.08%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，表1)。

表1 兩種組織的GRHL3、SEMA6B表達水平比較 (例)

2.不同GRHL3和SEMA6B表達水平結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征比較

不同GRHL3表達水平結(jié)直腸癌患者的腫瘤大小及TNM分期比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而性別、年齡、分化程度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05，表2)。不同SEMA6B表達水平結(jié)直腸癌患者的分化程度及TNM分期比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而性別、年齡、腫瘤大小比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05，表3)。

表2 不同GRHL3表達水平結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征比較 (例)

表3 不同SEMA6B表達水平結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征比較 (例)

3.不同GRHL3表達水平結(jié)直腸癌患者的MSCT灌注參數(shù)比較

GRHL3陽性與陰性表達結(jié)直腸癌患者(圖1、2)的BV比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；GRHL3陽性表達結(jié)直腸癌患者的BF顯著低于陰性表達者，TTP和PS顯著高于陰性表達者，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表4)。

圖1 患者，男，63歲，GRHL3陽性表達，SEMA6B陽性表達。a)BF偽彩圖，參數(shù)值為19.2mL/100g；b)BV偽彩圖，參數(shù)值為40.4mL/min·100g； c) TTP偽彩圖，參數(shù)值為20.5s； d) PS偽彩圖，參數(shù)值為32.8mL/min·100g。

圖2 患者，女，55歲，GRHL3陰性表達，SEMA6B陰性表達。a)BF偽彩圖，參數(shù)值為20.5mL/100g；b)BV偽彩圖，參數(shù)值為41.6mL/min·100g；c)TTP偽彩圖，參數(shù)值為18.4s；d)PS偽彩圖，參數(shù)值為30.5mL/min·100g。

表4 不同GRHL3表達水平結(jié)腸癌患者的MSCT灌注參數(shù)比較

3.不同SEMA6B表達水平結(jié)直腸癌患者的MSCT灌注參數(shù)比較

SEMA6B陽性與陰性表達結(jié)直腸癌患者的BV和PS比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SEMA6B陽性表達結(jié)直腸癌患者的BF顯著低于陰性表達者，TTP顯著高于陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05，表5)。

表5 不同SEMA6B表達水平結(jié)腸癌患者的MSCT灌注參數(shù)比較

4.MSCT灌注參數(shù)與結(jié)直腸癌MVD的相關(guān)性

MSCT灌注參數(shù)BV、BF、TTP、PS與MVD間均無顯著相關(guān)性(r值分別為0.115、0.108、-0.055和-0.081，P值分別為0.329、0.360、0.640和0.495，圖3)。

圖3 MSCT灌注參數(shù)與結(jié)直腸癌MVD的相關(guān)性散點圖。a)BV與MVD的相關(guān)性散點圖；b)BF與MVD的相關(guān)性散點圖；c)TTP與MVD的相關(guān)性散點圖；d)PS與MVD的相關(guān)性散點圖。

5.MSCT灌注參數(shù)與結(jié)直腸癌GRHL3、SEMA6B表達水平的二元Logistic回歸分析

以MSCT各灌注參數(shù)的中位值(BV：19.21 mL/100g；BF：40.42 mL/ min·100g；TTP：18.16 s；PS：

30.48 mL/min·100g)為截斷值，將其分為低水平和高水平，并進行賦值(低水平=0，高水平=1)。以GRHL3、SEMA6B表達水平(陰性表達=0，陽性表達=1)為因變量，將MSCT各灌注參數(shù)水平及臨床病理特征單因素分析有意義的變量納為自變量，進行多因素Logistic分析。結(jié)果顯示，高水平TTP是GRHL3陽性表達的獨立預測因子，高水平TTP及TNM分期III期是SEMA6B陽性表達的獨立預測因子(P值均<0.05，表6)。

表6 MSCT灌注參數(shù)與GRHL3、SEMA6B表達水平的二元Logistic回歸分析

討 論

結(jié)直腸癌是臨床上常見的一種胃腸道腫瘤，患者早期多無明顯的臨床癥狀，但隨著病情的進展，可能會出現(xiàn)便秘、腹瀉、腹痛及排血便等癥狀，晚期結(jié)腸癌患者會出現(xiàn)體重下降及嚴重貧血等，嚴重影響患者的生命健康和生活質(zhì)量[9]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制目前尚未明確，近年來隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，許多研究者開始關(guān)注結(jié)直腸癌相關(guān)病理和預后分子標志物的研究，以期找到結(jié)直腸癌分子靶向治療的突破點[10]。GRHL3和SEMA6B已被證實在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果顯示，GRHL3和SEMA6B在結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，這與之前的研究結(jié)果相似[4,6]。Tan等[4]的研究結(jié)果顯示，GRHL3在結(jié)直腸癌組織中表達顯著上調(diào)，并且GRHL3表達水平與結(jié)直腸癌的臨床病理特征相關(guān)，GRHL3高表達與腫瘤大小、TNM分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示GRHL3的高表達可能與結(jié)直腸癌惡性程度有潛在的相關(guān)性，此外，多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，GRHL3陽性是影響結(jié)直腸癌患者預后的獨立危險因素。本研究結(jié)果也顯示，腫瘤大小及TNM分期與GRHL3表達水平有關(guān)，陽性表達患者的腫瘤直徑較大，且TNM分期較晚。Li等[6]的研究結(jié)果表明，SEMA6B在結(jié)直腸癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，且多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示SEMA6B是結(jié)直腸癌患者無進展生存的獨立預后影響因素，SEMA6B高表達與低生存率密切相關(guān)，本研究結(jié)果提示，腫瘤分化程度及TNM分期與SEMA6B表達水平有關(guān)，陽性表達患者的腫瘤分化水平較高，且TNM分期較晚。因此，GRHL3和SEMA6B都是結(jié)直腸癌患者相關(guān)的預后分子標志物，術(shù)前通過影像學檢查無創(chuàng)性預測其在結(jié)直腸癌中的表達水平對疾病的臨床診治可提供一定參考價值。

MSCT灌注成像是通過增強CT掃描獲得動態(tài)CT圖像，測量對比劑在目標檢測組織的密度和時間變化，從而反映組織灌注狀態(tài)的一種影像學技術(shù)[11,12]。本研究結(jié)果顯示，MSCT灌注參數(shù)中的BF、TTP、PS與GRHL3的表達水平有關(guān)，BF、TTP與SEMA6B的表達水平有關(guān)。BF是指對比劑進入組織中的流速，可直接反映組織灌注狀態(tài)；TTP是指對比劑從開始注射時至組織強化達到峰值的時間，也是反映血流速度和組織灌注狀態(tài)的指標；PS是指對比劑由毛細血管進入細胞間隙的速率，可反映腫瘤成熟度和腫瘤血管網(wǎng)緊密性。豐富的血液供應是惡性腫瘤細胞快速增殖的必要條件[13]，惡性腫瘤新生血管網(wǎng)絡發(fā)達，血流速度快，病灶呈高灌注狀態(tài)[14]。之前的研究顯示，MSCT灌注參數(shù)與結(jié)直腸癌的臨床病理分期有關(guān)[8]，分期較晚的患者，其內(nèi)部可供腫瘤生存空間有限，組織內(nèi)壓力增大，使得毛細血管受壓，減慢了血流速度，從而延長了達峰時間。此外，由于血流量不足與腫瘤高度耗氧的矛盾存在，致使腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力增強。本研究通過以MSCT各灌注參數(shù)的中位數(shù)作為階段值將其分為不同水平，進一步應用二元Logistic回歸分析探討了MSCT各灌注參數(shù)與GRHL3、SEMA6B表達水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，較高的TTP是GRHL3和SEMA6B陽性表達的獨立預測因子。這一結(jié)果也提示，TTP較高時可能預示著患者預后較差。

此外，本研究還分析了MSCT各灌注參數(shù)與MVD的相關(guān)性，結(jié)果顯示BV、BF、TTP、PS與MVD間均不存在顯著相關(guān)性。雖然MVD在一定程度上可反映腫瘤新生血管的生成能力，但腫瘤內(nèi)血管生成存在不均一性，而應用免疫組化法檢測MVD值時，包括取材部位、染色方法和計數(shù)誤差等因素均會對結(jié)果判斷產(chǎn)生影響，因此MVD值并不能全面反映腫瘤的血管生成情況[8,15]。

本研究存在以下不足之處：首先，本研究納入的所有患者均來自同一家醫(yī)院，且樣本量不大，因此選擇偏倚不可避免；其次，結(jié)腸癌和直腸癌在影像檢查選擇、治療方式、預后等方面存在較大差異，但考慮到樣本量的局限，筆者未對其進行分別分析；最后，已有研究證實GRHL3、SEMA6B是結(jié)直腸癌的預后分子標志物，但相關(guān)的預后預測研究仍處于初步階段，并且因為灌注算法、ROI勾畫及空腔型臟器ROI勾畫困難等原因，CT灌注參數(shù)的重復性較低，這些因素給本研究帶來了一些不確定性，在未來有條件的情況下，我們會繼續(xù)對此進行研究。

綜上所述，MSCT灌注參數(shù)與結(jié)直腸癌GRHL3、SEMA6B表達水平具有一定相關(guān)性，高水平TTP是GRHL3和SEMA6B陽性表達的獨立預測因子。