聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖的毒性影響

陳 濤，徐曉平,2*，李彬彬，陶開(kāi)燕，謝 安，黃志鵬

1. 安徽工程大學(xué)建筑工程學(xué)院，安徽 蕪湖 2410002. 皖江流域退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建省部協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 蕪湖 241000

塑料制品已成為人類(lèi)生活不可或缺的一部分，特別是近年來(lái)，隨著快遞、外賣(mài)等行業(yè)的迅猛發(fā)展，塑料制品的使用頻次急劇上升造成了大量塑料垃圾. 研究[1]表明，全球范圍內(nèi)估計(jì)每年有4.80×106～1.27×107t塑料垃圾流入水環(huán)境中. 這些排入水體中的塑料在水解、風(fēng)化、光降解和生物降解等作用下會(huì)形成粒徑更小的微米級(jí)和納米級(jí)塑料微粒[2-3]. 這些粒徑較小的塑料微粒在自然作用以及人類(lèi)活動(dòng)的影響下進(jìn)入全球不同的水域中，在全球范圍內(nèi)不同水環(huán)境中均發(fā)現(xiàn)了微塑料污染的現(xiàn)象[4-6]. 我國(guó)長(zhǎng)江三峽大壩上游地表水中也檢測(cè)到每平方公里含有1.925×102～1.36175×104個(gè)微塑料顆粒[7]；此外，在天津市北塘排污河表層沉積物中測(cè)得微塑料平均豐度為202.17個(gè)/kg[8]. 這些流入自然水體中的塑料微粒不僅會(huì)進(jìn)一步加重水體的污染程度，甚至可能通過(guò)食物鏈富集等形式進(jìn)入人體并危害人類(lèi)健康.

微塑料(粒徑為0.1～5000 μm)和納米塑料(粒徑為1～100 nm)已經(jīng)被證明比普通塑料毒性作用更大，且它們?cè)谒w中分布廣泛，種類(lèi)繁多[9-12]. 研究[13-17]表明，微塑料和納米塑料能被水生生物吸入體內(nèi)并在體內(nèi)殘留，會(huì)對(duì)許多生物產(chǎn)生不利影響. 微米尺寸的塑料會(huì)給生物腸道造成物理?yè)p傷[18]，而納米尺寸的塑料由于其粒徑小、比表面積大，甚至可能通過(guò)生物屏障，穿過(guò)生物膜，對(duì)生物的功能和健康產(chǎn)生負(fù)面作用[19].Pitt等[20]研究發(fā)現(xiàn)，聚苯乙烯納米粒子在斑馬魚(yú)處于胚胎時(shí)期起在卵黃囊中積累，并在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中遷移到胃、腸道、肝臟、胰腺和心臟等部位，導(dǎo)致幼魚(yú)的行為受到影響. 田莉莉等[21]采用熒光和C-14同位素法研究了微塑料對(duì)海水青鳉的影響，發(fā)現(xiàn)青鳉攝食微塑料72 h后腸道內(nèi)仍有微塑料殘留. 此外，當(dāng)大型溞暴露于微塑料中會(huì)促進(jìn)其體內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等活性的升高，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[22].暴露于3種不同粒徑的聚苯乙烯微粒中會(huì)使褶皺臂尾輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)速度減慢、生殖力下降、壽命縮短以及繁殖時(shí)間延長(zhǎng)，并且誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[16].目前，關(guān)于微塑料和納米塑料對(duì)水生生物的毒理學(xué)研究[23-25]發(fā)現(xiàn)，水體中存在的塑料微粒會(huì)對(duì)多數(shù)水生生物產(chǎn)生危害.

輪蟲(chóng)作為水生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)消費(fèi)者，在維持整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)正常的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中發(fā)揮著重要作用. 由于輪蟲(chóng)分布廣泛、世代周期短、對(duì)毒物敏感和試驗(yàn)室易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，其被視為水生態(tài)系統(tǒng)中測(cè)試有毒物質(zhì)的模式生物. 此外，輪蟲(chóng)存在兩種生殖方式，它們?cè)谕饨鐥l件良好時(shí)進(jìn)行孤雌生殖，而當(dāng)外界條件發(fā)生改變且不利于輪蟲(chóng)種群正常生存時(shí)，它們會(huì)轉(zhuǎn)而進(jìn)行有性生殖，通過(guò)產(chǎn)休眠卵的方式來(lái)抵御外界環(huán)境的變化[26]. 研究[26-29]發(fā)現(xiàn)，輪蟲(chóng)種群有性生殖參數(shù)可以作為毒性測(cè)試的良好指標(biāo). 目前，關(guān)于聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)有性生殖的影響尚不清楚. 因此，該研究以萼花臂尾輪蟲(chóng)(Brachionus calyciflorus)為受試生物，運(yùn)用24 h急性毒性、168 h慢性毒性試驗(yàn)方法，研究了不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖的影響，旨在探明暴露于聚苯乙烯塑料中萼花臂尾輪蟲(chóng)試驗(yàn)種群增長(zhǎng)和有性生殖情況，以期為探明聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)類(lèi)重要浮游生物繁殖和種群增長(zhǎng)的影響提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 輪蟲(chóng)的來(lái)源和培養(yǎng)

試驗(yàn)選用的萼花臂尾輪蟲(chóng)是從蕪湖市鏡湖水體沉積物中挑選出的萼花臂尾輪蟲(chóng)休眠卵孵化所得. 采用EPA作為輪蟲(chóng)培養(yǎng)基[30]，斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)作為輪蟲(chóng)的唯一食物. 斜生柵藻采用HB-4培養(yǎng)基[31]培養(yǎng)，經(jīng)離心濃縮后置于4 ℃下保存使用. 試驗(yàn)開(kāi)始前，將一定數(shù)量的萼花臂尾輪蟲(chóng)置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間需超過(guò)7 d. 預(yù)培養(yǎng)期間，每天更換萼花臂尾輪蟲(chóng)培養(yǎng)基，并投喂密度為2.0×106cells/mL的斜生柵藻.

1.2 聚苯乙烯微塑料和納米塑料的性能和配制

試驗(yàn)所用的兩種粒徑的聚苯乙烯微塑料(0.5 μm、1 μm)和一種粒徑的聚苯乙烯納米塑料(100 nm)是由大鵝(天津)科技有限公司生產(chǎn). 使用Malvern Zetasizer Nano ZS90和 Malvern Instruments Z (馬爾文帕納科公司，英國(guó))兩種儀器檢測(cè)3種粒徑聚苯乙烯塑料粒子在蒸餾水中的平均粒徑、分散性指數(shù)和ζ-電位等指標(biāo)，每種指標(biāo)重復(fù)檢測(cè)3次. 聚苯乙烯微塑料和納米塑料原液在4 ℃下避光保存. 為了減小聚苯乙烯塑料粒子的聚集作用，在每次使用前進(jìn)行超聲處理(15 min). 試驗(yàn)開(kāi)始前，用蒸餾水配制1000 mg/L的聚苯乙烯微塑料或納米塑料母液，置于4 ℃下保存. 試驗(yàn)中不同濃度測(cè)試液均采用稀釋的方法配制，為了減少藻對(duì)聚苯乙烯微塑料和納米塑料顆粒的吸附以及塑料粒子自身聚集可能帶來(lái)的影響，測(cè)試液每24 h配制一次.

1.3 聚苯乙烯微塑料和納米塑料的攝入

為了研究輪蟲(chóng)對(duì)聚苯乙烯微塑料和納米塑料顆粒的攝入情況，從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機(jī)挑選萼花臂尾輪蟲(chóng)(500只左右)，暴露在10 mg/L的3種不同粒徑的聚苯乙烯微塑料或納米塑料測(cè)試液中(不含藻)，并置于(25±1)℃、無(wú)光照的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 24 h后，采用25 μm篩網(wǎng)過(guò)濾萼花臂尾輪蟲(chóng)，并用蒸餾水清洗暴露后萼花臂尾輪蟲(chóng)體表的聚苯乙烯微塑料或納米塑料，重復(fù)3次. 清洗后的萼花臂尾輪蟲(chóng)用4%甲醛固定，經(jīng)離心、干燥后備用. 采用掃描電子顯微鏡(SEM, Hitachi S-4800型, 日本日立公司)觀察萼花臂尾輪蟲(chóng)體內(nèi)的聚苯乙烯微塑料和納米塑料. 將干燥后的部分萼花臂尾輪蟲(chóng)樣品固定在SEM的樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金，然后進(jìn)行觀察.

1.4 急性毒性試驗(yàn)

為了研究聚苯乙烯微塑料和納米塑料在短期內(nèi)對(duì)輪蟲(chóng)的毒性作用，進(jìn)行了24 h急性毒性測(cè)試. 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，將100 nm聚苯乙烯納米塑料濃度設(shè)置為0.01、0.1、1、10和100 mg/L，0.5 μm聚苯乙烯微塑料濃度設(shè)置為10、25、50、100和200 mg/L，1 μm 聚苯乙烯微塑料濃度設(shè)置為1、10、100、200和400 mg/L，此外均設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組(EPA培養(yǎng)基). 試驗(yàn)在容積為6 mL的小玻璃杯中進(jìn)行，隨機(jī)挑選10只齡長(zhǎng)在6 h以?xún)?nèi)的萼花臂尾輪蟲(chóng)幼體于玻璃杯中，并加入5 mL不同濃度的測(cè)試液(不含斜生柵藻)，置于(25±1)℃、無(wú)光照的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù). 試驗(yàn)開(kāi)始24 h后，記錄每個(gè)玻璃杯中萼花臂尾輪蟲(chóng)存活數(shù)目，采用機(jī)率單位算法求得急性24 h-LC50(24 h半數(shù)致死濃度)值.

1.5 有性生殖試驗(yàn)

根據(jù)聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，將100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料的暴露濃度均設(shè)置為0.01、0.1、1、10和20 mg/L，另設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組(EPA培養(yǎng)基)，每組設(shè)置8個(gè)重復(fù).

從預(yù)培養(yǎng)的試管中挑選帶非混交卵的萼花臂尾輪蟲(chóng)雌體若干，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)相同)，2 h后收集萼花臂尾輪蟲(chóng)幼體. 隨機(jī)挑選3只輪蟲(chóng)幼體放入6 mL小玻璃杯中，加入5 mL不同濃度的測(cè)試液(內(nèi)含2.0×106cells/mL的斜生柵藻)，置于(25±1)℃、無(wú)光照的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng). 試驗(yàn)開(kāi)始48 h后，觀察并記錄各玻璃杯中萼花臂尾輪蟲(chóng)存活總數(shù)，用于計(jì)算萼花臂尾輪蟲(chóng)2 d種群增長(zhǎng)率；試驗(yàn)開(kāi)始96 h后，參考文獻(xiàn)[32]的方法，對(duì)輪蟲(chóng)雌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，用于計(jì)算輪蟲(chóng)混交率、受精率等指標(biāo)，計(jì)數(shù)后的輪蟲(chóng)返回新的測(cè)試液中繼續(xù)暴露，暴露條件不變；試驗(yàn)開(kāi)始168 h后，記錄混交雌體攜帶以及落入玻璃杯底部的休眠卵數(shù)量. 試驗(yàn)期間，每12 h懸浮一次沉積在玻璃杯底部的綠藻，每24 h更換一次測(cè)試液并投喂新鮮的藻.

種群增長(zhǎng)率(r)計(jì)算公式：

式中：Nt和N0分別為試驗(yàn)結(jié)束和試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的輪蟲(chóng)數(shù)量；t為時(shí)間，該研究中t取2 d；

有性生殖試驗(yàn)包含以下指標(biāo)：OF/NOF為攜卵的雌體數(shù)與不攜卵的雌體數(shù)的比值；MF/AF為攜卵的雌體中混交雌體數(shù)與非混交雌體數(shù)的比值；MR(混交率)為種群中混交雌體數(shù)與雌體總數(shù)的比值；FR(受精率)為種群中受精的混交雌體數(shù)與混交雌體總數(shù)的比值；RE(休眠卵產(chǎn)量)為5 mL培養(yǎng)液中輪蟲(chóng)在7 d內(nèi)所產(chǎn)的休眠卵總數(shù)[28]；NOEC為最大未觀察到效應(yīng)濃度，mg/L；LOEC為最小觀察到效應(yīng)濃度，mg/L. 根據(jù)單因素方差分析結(jié)果確定各參數(shù)的NOEC和LOEC.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析. 利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較(LSD檢驗(yàn))法比較輪蟲(chóng)各濃度組有性生殖指標(biāo)與對(duì)照組間的差異顯著性，P＜0.05表示顯著性差異. 此外，對(duì)輪蟲(chóng)有性生殖參數(shù)與不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料濃度間的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行回歸分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚苯乙烯微塑料和納米塑料特性

100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm 聚苯乙烯微塑料在蒸餾水中的平均粒徑、分散性指數(shù)和ζ-電位值如表1所示. 數(shù)據(jù)顯示，與1 μm聚苯乙烯微塑料相比，100 nm聚苯乙烯納米塑料和0.5 μm聚苯乙烯微塑料在蒸餾水中穩(wěn)定性更高，聚集程度更低.

表1 不同尺寸聚苯乙烯微塑料和納米塑料在蒸餾水中的參數(shù)Table 1 Parameters of the different size polystyrene microplastics and nanoplastics in the distilled water

2.2 聚苯乙烯微塑料和納米塑料的攝入

圖1為100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料原液經(jīng)過(guò)濾、干燥后電鏡掃描結(jié)果.圖2為空白對(duì)照組和暴露于10 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料溶液中24 h后被攝入和沉積在輪蟲(chóng)體內(nèi)的情況. 由圖2可見(jiàn)，暴露24 h后聚苯乙烯微塑料和納米塑料已被攝入并沉積在輪蟲(chóng)體內(nèi).

圖1 不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料原液的SEM圖Fig.1 SEM images of polystyrene microplastics and nanoplastics with different sizes

圖2 萼花臂尾輪蟲(chóng)24 h攝入不同粒徑聚苯乙烯塑料的SEM圖Fig.2 SEM Images of the polystyrene plastics of different particle sizes ingested by Brachionus calyciflorus in 24 h

2.3 聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)顯示，隨著聚苯乙烯塑料粒徑的增加，100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的24 h-LC50值不斷升高，表明隨著聚苯乙烯塑料粒徑的增加，其對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性減小.

表2 不同尺寸聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的24 h半致死濃度Table 2 The 24 h median lethal concentration for Brachionus calyciflorus exposed to polystyrene microplastics and nanoplastics of different diameters

2.4 聚苯乙烯塑料對(duì)輪蟲(chóng)有性生殖的影響

單因素方差分析結(jié)果表明，不同粒徑的聚苯乙烯塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)2 d種群增長(zhǎng)率影響不同. 0.5 μm聚苯乙烯微塑料對(duì)輪蟲(chóng)2 d種群增長(zhǎng)率有影響，但影響不顯著(P＞0.05)；100 nm聚苯乙烯納米塑料和1 μm聚苯乙烯微塑料均可引起輪蟲(chóng)種群數(shù)量的顯著變化(P均小于0.05). 與對(duì)照相比，暴露于20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料均顯著降低了輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)率(P均小于0.05)(見(jiàn)表3).

0.5、1 μm聚苯乙烯微塑料和100 nm聚苯乙烯納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)4 d 的OF/NOF值均有顯著影響. 與對(duì)照組相比，10 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.01、0.1、1、20 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料均顯著降低了OF/NOF值(P均小于0.05)；0.01和10 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料則顯著增加了OF/NOF值(P均小于0.05). 10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料均顯著降低了輪蟲(chóng)的MF/AF值(P均小于0.05)，其他處理組則無(wú)顯著變化(見(jiàn)表3).

0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料以及100 nm聚苯乙烯納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)4 d混交率(MR)均有顯著影響(見(jiàn)表3). 與對(duì)照組相比，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料均顯著降低輪蟲(chóng)的混交率(P均小于0.05)，且混交率為0. 暴露于0.01、1和20 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著降低了44.3%、66.2%和41.4%的輪蟲(chóng)混交率(P均小于0.05)；而與對(duì)照組相比，暴露于0.01、0.1、1和10 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著增加了139.7%、55.3%、110.2%和118.6%的輪蟲(chóng)混交率(P均小于0.05).

與對(duì)照組相比，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料導(dǎo)致輪蟲(chóng)的受精率(FR)顯著降低，且受精率均為0 (P均小于0.05)；暴露于0.01和0.1 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著增加了105.0%和79.9%的輪蟲(chóng)受精率(P均小于0.05)；0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料對(duì)輪蟲(chóng)受精率均無(wú)顯著影響(見(jiàn)表3).

單因素方差分析結(jié)果顯示，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料和100 nm聚苯乙烯納米塑料均對(duì)輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量具有顯著影響(P均小于0.05). 暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料均顯著降低輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量，休眠卵產(chǎn)量均為0 (P均小于0.05)，與納米塑料對(duì)受精率的影響相似. 暴露于0.01、0.1、1、10和20 mg/L的0.5 μm聚苯乙烯微塑料分別顯著增加了292.9%、307.1%、290.0%、514.3%和152.9%的輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量(P均小于0.05)；暴露于0.1 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料對(duì)輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量也有顯著促進(jìn)作用(P＜0.05)，與對(duì)照組相比，休眠卵產(chǎn)量增加了50.6%(見(jiàn)表3).

表3 暴露于不同濃度聚苯乙烯微塑料和納米塑料中萼花臂尾輪蟲(chóng)的有性生殖參數(shù)Table 3 The reproductive parameters of Brachionus calyciflorus exposed to different concentrations of polystyrene microplastics and nanoplastics

回歸分析結(jié)果(見(jiàn)表4)顯示，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料以及100 nm聚苯乙烯納米塑料濃度的對(duì)數(shù)值均與輪蟲(chóng)有性生殖指標(biāo)之間存在不同程度的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中，100 nm聚苯乙烯納米塑料濃度的對(duì)數(shù)值與輪蟲(chóng)受精率和休眠卵產(chǎn)量之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料濃度的對(duì)數(shù)值則分別與輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率和休眠卵產(chǎn)量存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系. 由表5可見(jiàn)，暴露于1 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率、混交率和休眠卵產(chǎn)量的LOEC值均較低，暴露于0.5 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲(chóng)混交率和休眠卵產(chǎn)量的LOEC值均較低.

表4 萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖參數(shù)與聚苯乙烯微塑料和納米塑料濃度對(duì)數(shù)值之間的關(guān)系Table 4 Relationships between the reproductive parameters of Brachionus calyciflorus and logarithm concentration of polystyrene microplastics and nanoplastics

表5 暴露于聚苯乙烯微塑料和納米塑料中萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖參數(shù)的NOEC、LOEC值Table 5 NOEC and LOEC values of the sexual reproductive parameters of Brachionus calyciflorus exposed to polystyrene microplastics and nanoplastics

3 討論

3.1 聚苯乙烯塑料對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性影響

萼花臂尾輪蟲(chóng)作為水生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，由于其對(duì)毒物十分敏感，在殺蟲(chóng)劑、重金屬、抗生素等毒物測(cè)試中得到廣泛應(yīng)用[33-36]. 因此，該研究選用萼花臂尾輪蟲(chóng)作為受試生物，探究了不同粒徑聚苯乙烯塑料對(duì)輪蟲(chóng)繁殖的影響. 急性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分別暴露于100 nm、0.5 μm和1 μm三種粒徑的聚苯乙烯塑料24 h后，隨著聚苯乙烯塑料粒徑的增大，輪蟲(chóng)的24 h-LC50值升高，表明隨著塑料粒徑的增大，其對(duì)輪蟲(chóng)的毒性作用在降低. 研究[16,37]發(fā)現(xiàn)，與大粒徑的微塑料相比，小粒徑的納米塑料具有更高的生物活性，更易穿透生物膜且毒性更強(qiáng)，對(duì)生物機(jī)體會(huì)造成更大的傷害. 因此，相同濃度下聚苯乙烯微塑料和納米塑料的粒徑越小，顆粒越多，對(duì)輪蟲(chóng)的急性毒性更強(qiáng).

急性試驗(yàn)作為一種標(biāo)準(zhǔn)的毒物測(cè)試方法，在毒理學(xué)研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[38]. 但僅依靠急性試驗(yàn)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)毒物的毒性作用，可能會(huì)忽視毒物與生物體之間復(fù)雜的化學(xué)或生物作用，從而影響毒理學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果的完整性和準(zhǔn)確性. 此外，不同材質(zhì)的塑料顆粒在水體中分布廣泛，且濃度較低，水生生物長(zhǎng)期暴露在低濃度的塑料粒子中會(huì)產(chǎn)生慢性毒性作用. 因此，該研究還探討了不同粒徑聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖的慢性毒性影響.

3.2 聚苯乙烯塑料對(duì)輪蟲(chóng)種群的影響

目前，關(guān)于微塑料和納米塑料污染物對(duì)藻類(lèi)、輪蟲(chóng)和大型溞等水生生物種群增長(zhǎng)的影響已有報(bào)道[15,16,39-41]. Zhang等[42]研究了微塑料與海洋中肋骨條藻(Skeletonema costatum)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)聚氯乙烯微塑料會(huì)嵌入微藻細(xì)胞壁，對(duì)藻類(lèi)細(xì)胞表面造成物理?yè)p傷，從而限制細(xì)胞與環(huán)境之間能量和物質(zhì)的交換. Jeong等[16]發(fā)現(xiàn)，高濃度的0.05 μm聚苯乙烯微球?qū)喯x(chóng)的毒性作用顯著高于0.5和6 μm聚苯乙烯微球，暴露于6 μm聚苯乙烯微球后輪蟲(chóng)只表現(xiàn)出輕微的生長(zhǎng)遲緩. 筆者研究中，萼花臂尾輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制程度也與聚苯乙烯塑料粒徑密切相關(guān). 與Liu等[15]試驗(yàn)結(jié)果不同，筆者研究中暴露于100 nm聚苯乙烯納米塑料后，高濃度的聚苯乙烯納米塑料顯著抑制了輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率，而低濃度的聚苯乙烯納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率無(wú)顯著影響；當(dāng)輪蟲(chóng)暴露于0.5 μm聚苯乙烯微塑料時(shí)，種群增長(zhǎng)率卻無(wú)顯著變化；暴露于0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料均顯著抑制輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率. 輪蟲(chóng)作為濾食性動(dòng)物，其通過(guò)自身不斷的旋轉(zhuǎn)游動(dòng)來(lái)攝取環(huán)境中的食物，而在試驗(yàn)期間由于攝入了大量聚苯乙烯微塑料和納米塑料，導(dǎo)致其從綠藻中攝入營(yíng)養(yǎng)不足，從而影響輪蟲(chóng)的存活與繁殖，這與Lisbeth等[43]研究結(jié)果類(lèi)似. 研究[16,41]表明，輪蟲(chóng)能攝入粒徑較小的微塑料，并且在胃、腸道等消化器官中積累. 當(dāng)輪蟲(chóng)暴露在濃度較高的100 nm聚苯乙烯納米塑料中，由于相同濃度的小粒徑納米塑料的數(shù)量更多，納米塑料更有可能透過(guò)生物膜進(jìn)入組織和細(xì)胞內(nèi)，對(duì)輪蟲(chóng)產(chǎn)生了氧化損傷；而暴露于粒徑相對(duì)較大的0.5 μm聚苯乙烯微塑料時(shí)，微塑料進(jìn)入組織和細(xì)胞的可能性較小，可能只在輪蟲(chóng)腸道內(nèi)殘留，并不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的影響；而輪蟲(chóng)暴露于1 μm聚苯乙烯微塑料時(shí)，輪蟲(chóng)排泄物顆粒較大、呈團(tuán)狀，且在輪蟲(chóng)體表停留時(shí)間較長(zhǎng). 研究[7]表明，攝入輪蟲(chóng)體內(nèi)的聚苯乙烯微塑料可能會(huì)影響輪蟲(chóng)的浮力和游泳行為，進(jìn)而影響輪蟲(chóng)食物的攝入. SEM測(cè)試結(jié)果也表明，暴露于100 nm聚苯乙烯納米塑料以及0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料24 h后，塑料顆粒在輪蟲(chóng)體內(nèi)積累，且小粒徑的塑料顆粒在體內(nèi)積累的數(shù)量更多，這可能是導(dǎo)致小粒徑納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)毒性作用更大的原因. 值得注意的是，微塑料和納米塑料的攝入可能導(dǎo)致其從水體進(jìn)入生物體和沉積物中，這些微塑料和納米塑料不僅會(huì)對(duì)輪蟲(chóng)產(chǎn)生威脅，還會(huì)對(duì)輪蟲(chóng)所處的食物鏈或食物網(wǎng)產(chǎn)生較大影響，甚至經(jīng)食物鏈傳播進(jìn)入人體，對(duì)人類(lèi)的健康存在一定風(fēng)險(xiǎn). 因此，關(guān)于不同粒徑微塑料和納米塑料在輪蟲(chóng)體內(nèi)積累和排泄的過(guò)程值得關(guān)注.

3.3 聚苯乙烯塑料對(duì)輪蟲(chóng)有性生殖的影響

單因素方差分析結(jié)果顯示，0.5和1 μm聚苯乙烯微塑料以及100 nm聚苯乙烯納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)混交率均有顯著影響. 100 nm聚苯乙烯納米塑料和0.5 μm聚苯乙烯微塑料均顯著抑制了輪蟲(chóng)混交率，而1 μm聚苯乙烯微塑料則顯著增加了輪蟲(chóng)混交率，表明3種塑料粒子對(duì)輪蟲(chóng)的生殖已經(jīng)顯示出較高的毒性作用. 與對(duì)照組相比，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料中輪蟲(chóng)的混交率為0，說(shuō)明輪蟲(chóng)的混交行為受到抑制，輪蟲(chóng)的有性生殖行為減少. 然而，與其他兩種粒徑的聚苯乙烯塑料相比，暴露于相同濃度的1 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲(chóng)混交率更高. 推測(cè)可能是大顆粒聚苯乙烯微塑料影響了輪蟲(chóng)的正常生命活動(dòng)，種群增長(zhǎng)受到抑制，使得輪蟲(chóng)轉(zhuǎn)變生殖方式，輪蟲(chóng)群體中出現(xiàn)大量混交雌體所致. 一般認(rèn)為，輪蟲(chóng)在受到毒物脅迫時(shí)輪蟲(chóng)親代會(huì)將更多的能量投入到解毒過(guò)程中，從而導(dǎo)致子代數(shù)量和質(zhì)量的降低[44]. 3種粒徑聚苯乙烯塑料暴露后LOEC結(jié)果顯示，暴露于較低濃度的聚苯乙烯塑料中即可引起輪蟲(chóng)混交率發(fā)生顯著變化，表明混交率可以作為評(píng)價(jià)聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)毒性作用的一個(gè)敏感參數(shù). Xi等[32]研究了4種有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑對(duì)輪蟲(chóng)的生殖影響，發(fā)現(xiàn)混交率是一個(gè)合適的毒性評(píng)價(jià)測(cè)試終點(diǎn)，與筆者試驗(yàn)結(jié)果一致.

在評(píng)價(jià)污染物對(duì)輪蟲(chóng)有性生殖毒性時(shí)，受精率也是一個(gè)重要的監(jiān)測(cè)指標(biāo). Tian等[45]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸酮(testosterone)與不同濃度氟他胺(flutamide)聯(lián)合暴露時(shí)，對(duì)輪蟲(chóng)種群混交雌體受精率有顯著抑制作用，進(jìn)而可能影響輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量. 當(dāng)試驗(yàn)系統(tǒng)中輪蟲(chóng)混交雌體數(shù)幾乎為0時(shí)，會(huì)導(dǎo)致輪蟲(chóng)受精過(guò)程無(wú)法完成，從而導(dǎo)致受精率下降，休眠卵無(wú)法產(chǎn)生. 筆者研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，試驗(yàn)開(kāi)始168 h后，暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料中輪蟲(chóng)的休眠卵產(chǎn)量為0. 而與對(duì)照組相比，低濃度的0.5 μm聚苯乙烯微塑料對(duì)輪蟲(chóng)的受精率有顯著促進(jìn)作用，高濃度也呈現(xiàn)促進(jìn)作用但不顯著. 推測(cè)暴露于低濃度0.5 μm聚苯乙烯微塑料后，輪蟲(chóng)受精作用增強(qiáng)，輪蟲(chóng)休眠卵的產(chǎn)量也隨之增加. 暴露于1 μm聚苯乙烯微塑料后，輪蟲(chóng)混交率顯著增加，而受精率無(wú)顯著影響，推測(cè)該暴露條件下輪蟲(chóng)受精行為受到影響. 筆者研究發(fā)現(xiàn)，輪蟲(chóng)生殖方式的改變與聚苯乙烯塑料粒徑之間緊密相關(guān).

休眠卵作為輪蟲(chóng)有性生殖的最終產(chǎn)物，被認(rèn)為是輪蟲(chóng)的“種子”，輪蟲(chóng)通過(guò)轉(zhuǎn)變生殖方式產(chǎn)生休眠卵來(lái)躲避外界不利的條件，以保證輪蟲(chóng)種群的延續(xù)性.在毒理學(xué)試驗(yàn)中，休眠卵產(chǎn)量是比輪蟲(chóng)其他種群參數(shù)對(duì)污染物更為敏感的指標(biāo)[46]. 筆者研究中暴露于10和20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料后，輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量、混交率和受精率均受到顯著抑制；暴露于0.5 μm聚苯乙烯微塑料中輪蟲(chóng)的混交率受到一定程度的抑制，受精率受到一定程度的促進(jìn)，而休眠卵產(chǎn)量表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，可能與微塑料暴露后，輪蟲(chóng)的受精作用加強(qiáng)有關(guān)；暴露于不同濃度(除20 mg/L外)的1 μm聚苯乙烯微塑料中，輪蟲(chóng)混交率均顯著增加，意味著試驗(yàn)體系中混交雌體數(shù)量增加，輪蟲(chóng)受精概率增大，但各處理組中輪蟲(chóng)受精率無(wú)顯著變化，且休眠卵產(chǎn)量只在0.1 mg/L下顯著增加. 由此可見(jiàn)，輪蟲(chóng)休眠卵的產(chǎn)生是多種因素共同作用的結(jié)果，單一指標(biāo)的變化并不能決定最終休眠卵的產(chǎn)量. Tian等[45,47]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于幾種不同內(nèi)分泌干擾素中輪蟲(chóng)有性生殖指標(biāo)也會(huì)發(fā)生改變. 推測(cè)聚苯乙烯微塑料和納米塑料暴露導(dǎo)致輪蟲(chóng)體內(nèi)某些激素含量的變化可能是輪蟲(chóng)生殖方式發(fā)生改變的一個(gè)原因，關(guān)于輪蟲(chóng)生殖方式發(fā)生轉(zhuǎn)變的內(nèi)在機(jī)制還需進(jìn)一步研究.

該研究在評(píng)價(jià)聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)各有性生殖指標(biāo)影響時(shí)，低濃度的聚苯乙烯微塑料和納米塑料即可引起輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量的顯著變化，說(shuō)明可以選用輪蟲(chóng)休眠卵產(chǎn)量來(lái)評(píng)價(jià)自然水體中聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)的有性生殖毒性. 然而，由于污染物自身性質(zhì)和輪蟲(chóng)品系不同，在評(píng)價(jià)聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)各指標(biāo)的敏感性時(shí)可能存在一定差異，還需要進(jìn)一步研究. 輪蟲(chóng)在整個(gè)淡水生態(tài)系統(tǒng)中扮演著非常重要的作用，當(dāng)輪蟲(chóng)轉(zhuǎn)變生殖方式進(jìn)行有性生殖時(shí)，必然導(dǎo)致短期內(nèi)整個(gè)輪蟲(chóng)種群數(shù)量的變化，進(jìn)而影響整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)[48-49]. 因此，如何正確、全面地評(píng)價(jià)水中聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)輪蟲(chóng)種群的影響及其帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)還有待進(jìn)一步研究.

4 結(jié)論

a) 聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)萼花臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性與聚苯乙烯塑料粒徑有關(guān)，暴露于粒徑較小的聚苯乙烯納米塑料后輪蟲(chóng)的24 h-LC50值較低，急性毒性較大.

b) 暴露于20 mg/L的100 nm聚苯乙烯納米塑料和0.01、0.1、1、10和20 mg/L的1 μm聚苯乙烯微塑料中，輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)率均顯著降低.

c) 暴露于聚苯乙烯微塑料和納米塑料均會(huì)導(dǎo)致輪蟲(chóng)有性生殖增加，產(chǎn)生更多的休眠卵，使整個(gè)輪蟲(chóng)種群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能對(duì)整個(gè)水生態(tài)系統(tǒng)存在一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).

d) 在評(píng)價(jià)聚苯乙烯微塑料和納米塑料對(duì)蕪湖水體萼花臂尾輪蟲(chóng)有性生殖參數(shù)影響時(shí)，各參數(shù)的敏感性不同，低濃度的聚苯乙烯微塑料和納米塑料暴露即可引起輪蟲(chóng)混交率和休眠卵產(chǎn)量的顯著變化，表明輪蟲(chóng)混交率和休眠卵產(chǎn)量可以作為合適的測(cè)試指標(biāo).