乙醛脫氫酶1B1、LRFN4在結直腸癌組織中的表達與臨床病理特征及預后的關系

陳林濤 姚毅明 周學偉 王紅雷

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種消化道系統的惡性腫瘤，近年來，結直腸癌在我國的發病率和死亡率均呈上升趨勢，且生存率偏低，5年生存率仍低于40%[1-2]，這主要是飲食結構發生改變、癌癥的早期篩查不足所導致的[3]。因此，篩選有效且靈敏的結直腸癌生物標志物對其預防、早期診斷和預后改善具有重要意義。LRFN4屬于LRFN家族蛋白，是一種神經元特異性蛋白，研究報道，LRFN4可在多種腫瘤中表達[4]。乙醛脫氫酶1A1(ALDH1A1)在胃癌、神經膠質瘤等多種腫瘤中異常表達，且與預后有關。ALDH1B1與ALDH1A1具有同源性，且ALDH1B1在正常小腸、肝臟和胰腺組織中呈高水平表達[5-6]。但LRFN4、ALDH1B1表達在結直腸癌中的研究較少，因此本研究分析LRFN4、ALDH1B1與結直腸癌患者的臨床病理特征及預后的關系，探討LRFN4、ALDH1B1與結直腸癌發生發展及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年1月本院收治的結直腸癌患者90例，年齡18～69歲，平均(57.32 ±7.64)歲。納入標準：①符合《中國結直腸癌診療規范(2020年版)》[7]中關于結直腸癌的診斷標準，患者經病理檢查確診為結直腸癌； ② 接受規范性的結直腸癌根治手術，且術前未進行任何抗腫瘤治療；③患者簽署自愿受試同意書及知情同意書。排除標準：①臨床病歷信息和隨訪資料不完整；②合并其他惡性腫瘤患者；③術前已轉移、接受姑息性切除的患者。

1.2 ALDH1B1、LRFN4檢測

收集結直腸癌組織，采用Quick-Ray手動組織芯片儀(美國UNITMA公司)取直徑2.0 mm的組織制成組織微陣列(TMA)芯片蠟塊，經脫蠟水化與抗原修復后，分別滴加兔抗人LRFN4抗體以及ALDH1B1抗體(賽默飛世爾科技有限公司)，PBS沖洗后滴加二抗(賽默飛世爾科技有限公司)。免疫組化結果：在高倍鏡下觀察，細胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，陽性細胞染色強度分值：0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(中等陽性)、3分(強陽性)。陽性細胞所占百分比0～1%為0分，>1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強度和陽性細胞的百分比兩者相乘獲得0～12分的總染色得分，其中0～4分定義為低表達或無表達，5～12分定義為高表達。

1.3 臨床資料收集及隨訪

通過查閱患者病歷檔案，收集患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤組織學分級、TNM分期等。采用電話或門診復診等隨訪方式，截止時間為2021年2月。記錄患者的總生存期(overall survival，OS)：確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 結直腸癌患者組織ALDH1B1、LRFN4的表達與臨床病理特征關系

在結直腸癌組織中LRFN4表達與淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P<0.05)，與年齡、性別、組織學分級等病理特征無關(P>0.05)；在結直腸癌組織中ALDH1B1表達與TNM分期顯著相關(P<0.05)，與其他病理特征無關(P>0.05)，見表1。

表1 結直腸癌患者組織ALDH1B1、LRFN4的表達與臨床病理特征關系/例

2.2 ALDH1B1、LRFN4表達與結直腸癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示：LRFN4高表達患者的總生存率顯著高于低表達組，差異有統計學意義(P=0.027)；ALDH1B1高表達患者的總生存率顯著低于低表達組，差異有統計學意義(P=0.025)。見圖1。

圖1 結直腸癌患者 Kaplan-Meier生存曲線

2.3 影響結直腸癌患者預后的單因素和多因素分析

單因素分析發現ALDH1B1表達、LRFN4表達和TNM分期與結直腸癌的不良預后有關，將上述單因素引入多因素Cox回歸模型分析發現ALDH1B1表達、LRFN4表達和TNM分期是結直腸癌患者預后的獨立影響指標，見表2。

表2 ALDH1B1、LRFN4與預后的單因素和多因素分析

3 討論

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，是全球第三大常見惡性腫瘤，雖然目前在對其的治療取得了很大的進步，但是治療后的結直腸癌患者依然存在轉移和復發的風險[8-9]。因此結直腸癌在治療和預后監測上面臨巨大挑戰，尋找能預測結直腸癌患者預后的生物標志物是目前臨床上關注的重點。 ALDHs是一組催化醛類氧化為羧酸的依賴性酶，已被研究證實可作為多種癌癥的生物標志物[10]，其中ALDH1是ALDHs超家族成員之一，ALDH1的亞型包括ALDH1B1和ALDH1A1[11]。研究報道ALDH1B1在肺、乳腺、卵巢的腺癌組織中均有表達，另外有研究顯示ALDH1B1在結直腸癌組織中的表達高于癌旁組織，且高于ALDH1A1陽性表達率[12-13]。本研究結果顯示結直腸癌組織中ALDH1B1表達與TNM分期顯著相關，ALDH1B1高表達患者的總生存率顯著低于低表達組，且ALDH1B1表達是結直腸癌患者預后的獨立指標。這提示ALDH1B1表達與結直腸癌的預后有關，ALDH1B1表達與患者的總生存期呈負相關，說明ALDH1B1在結直腸癌的表達越高，其患者預后越差。 LRFN又稱突觸黏附樣分子，共有5名家族成員，其結構域相似，但是各自的功能不同，以前的研究僅限于LRFN家族成員在神經組織的表達和功能上的探討，研究發現下調LRFN1的表達會導致胰腺癌細胞的存活率發生下降，在某些包括Panc-1、MKN7等癌細胞系中也會發現LRFN4的表達[14-15]。腫瘤細胞可以募集包括間充質細胞、內皮細胞、免疫細胞和成纖維細胞在內的基質細胞，促進腫瘤生長并向遠處轉移[16-17]。其中免疫細胞可通過誘導和維持腫瘤血管生成，刺激腫瘤細胞增殖、組織浸潤，向遠處轉移[18-19]。根據研究報道在具有巨噬細胞分化的單核細胞中LRFN4的表達被上調，在誘導單核細胞/巨噬細胞向炎癥區域的遷移中起到了關鍵性作用，因此可以推測LRFN4有參與結直腸癌的傳播、復發等過程，誘導巨噬細胞免疫、腫瘤細胞生長受限制[20-21]。本研究結果顯示結直腸癌組織中LRFN4表達與淋巴結轉移、TNM分期顯著相關，LRFN4高表達患者的總生存率顯著高于低表達組，顯著降低了結直腸癌患者的死亡風險，是結直腸癌患者獨立預后的指標。這提示結直腸癌組織中LRFN4高表達可能起著抑制腫瘤進展的作用，可能成為評估患者預后的生物學指標。

綜上所述，結直腸癌組織中ALDH1B1、LRFN4的表達與臨床病理特征及預后密切相關，有成為預測結直腸癌患者預后生物標志物的潛力，亦有望成為腫瘤生物治療的新靶點。然而，本研究存在一定的不足，首先本研究僅限于臨床樣本分析，未在細胞及動物層次上進一步分析ALDH1B1和LRFN4表達對結直腸癌的作用機制；其次本研究為單一中心，收集樣本為90例，存在樣本量不足的問題，結果可能產生偏移，需要未來制定更具前瞻性的試驗研究來驗證。