骨骼干細胞的研究進展

林茜茜，張 龍，袁桂鑫，吳佐星，馮昊天，李 娜，許 韌*

(1.廈門大學醫學院，細胞應激生物學國家重點實驗室，福建 廈門 361102；2.汕頭大學醫學院第二附屬醫院，廣東 汕頭 515041；3.內蒙古乳業技術研究院有限責任公司,內蒙古 呼和浩特 010110；4.內蒙古伊利實業集團股份有限公司,內蒙古 呼和浩特 010110)

骨骼干細胞(SSCs)的定義基于特異性的細胞表面免疫標志物，是一個相對較新的概念.近期，Chan等[1-2]利用單細胞測序、流式細胞分選和譜系示蹤技術相繼鑒定出小鼠和人類的SSCs及其分化等級.SSCs的概念區別于間充質干細胞(MSCs).MSCs主要存在于骨髓腔內，具有分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的多向分化潛能；而SSCs主要位于生長板和骨外膜，能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞和基質細胞，但不具備分化成脂肪細胞的能力[3-4].本文分別從基本定義和分化等級、骨內的組織分布情況、骨骼損傷修復中的作用及臨床骨骼疾病中的應用4個方面詳細闡述SSCs目前的研究進展.

1 SSCs的定義及分化等級

小鼠的SSCs是從新生小鼠的長骨中分離得到的，通過CD45-TER119-TIE2-ITGAV+CD200+(CD45為白細胞共同抗原，TER119為紅細胞表面抗原，TIE2為內皮細胞Tek酪氨酸激酶，ITGAV為整合素αV，CD200為Ox-2膜糖蛋白)分選并定義小鼠的SSCs[1].通過流式分析、單細胞測序和免疫熒光染色的方法，人類的SSCs最初在17周胎兒長骨生長板中被鑒定，并定義為CD146-PDPN+CD73+CD164+(PDPN為平足蛋白)的一群細胞.這群細胞具有自我更新的能力，能夠連續產生細胞群落形成單位，在小鼠腎下移植，能夠分化出含有骨、軟骨和基質的多向性小骨[2]：首先分化出早期骨、軟骨和基質的祖細胞，接著是骨祖細胞和軟骨祖細胞，最后才分化出骨骼細胞、軟骨細胞和基質細胞.然而，人類SSCs不會分化為脂肪細胞.在急性骨骼損傷后，人類SSCs會在損傷部位發生顯著的局部擴張，表明人類SSCs作為干細胞對骨骼損傷具有再生反應.此外，分化出的基質可以在無血清培養條件下維持人造血干細胞的生長，還能夠表達多種潛在的造血支持細胞因子，包括人血管生成素1(ANGPT1)、集落刺激因子1(CSF1)、C-X-C基序趨化因子配體12(CXCL12)、白細胞介素-27(IL-27)、IL-7和干細胞因子(SCF)等.研究人員進一步探索人類SSCs的起源，通過單細胞轉錄組測序，分析孕5周和8周的人類胚胎的肢芽和長骨樣本，發現一群具有分化為成骨前體細胞和軟骨細胞潛能的胚胎骨骼干祖細胞(eSSPC)；這群細胞定位于軟骨外膜，具有自我更新的能力和分化潛能；轉錄調控網絡分析發現eSSPC中富集轉錄因子FOXP1/2[5].免疫熒光染色顯示FOXP1/2+細胞主要定位于軟骨外膜和新生的初級骨化中心內部，類似于小鼠體內發現的位于軟骨外膜的Foxp1/2/4調控的前體細胞[5-6].

小鼠和人類的SSCs(及其相應的祖細胞)的分化等級可以根據其細胞表面的免疫標記變化定義.小鼠SSCs(ITGAV+CD200+)處于分化的最頂端，進一步分化為骨、軟骨和基質祖細胞(BCSP,ITGAV+CD105+).BCSP仍具有多向分化的能力，可以分化為骨祖細胞(ITGAV+CD105+Thy+,其中Thy為胸苷酸合成酶)、軟骨祖細胞(ITGAV+CD200+CD105+Thy+)、基質細胞(6C3+)和B淋巴細胞(ITGAV+Thy+).人類的SSCs(CD164+PDPN+CD73+)具有最強的自我更新和分化能力，類似于小鼠的分化等級，人類SSCs分化成具有多向分化能力的BCSP(CD146+PDPN+).人類的BCSP可以分化成軟骨祖細胞(CD146-PDPN+)、骨祖細胞(CD146+ThyhighPDPN-)和基質細胞(CD146+ThylowPDPN-)[1-2].目前，SSCs的研究仍存在一定的局限，分化等級還需要進一步細化，主要是各分化階段SSCs所處的空間及微環境仍有待進一步闡明.

衰老的SSCs會產生一種炎癥退化微環境，不僅會導致骨折愈合不良、骨質疏松癥、各種血液疾病，還會促進全身細胞和系統的普遍炎癥，加速全身衰老.Ambrosi等[7]研究發現：在骨折愈合的過程中，骨折處形成骨痂，骨痂內充滿SSCs；而在年老小鼠中，愈合部位的SSCs明顯減少.此外，與年輕的SSCs相比，體外衰老的SSCs形成集落或成骨的能力也較差.正常情況下，骨組織在舊骨吸收、新骨形成的動態平衡中不斷地更新、修復，但在年老的骨骼中，衰老的SSCs所表達的基因與骨形成減少和骨吸收增加有關，這種不平衡最終導致骨質疏松癥以及骨折愈合延遲.適量的CSF1是骨骼愈合所必需的，與年齡有關的CSF1數量的增加會刺激破骨細胞的增多，因此衰老的SSCs分泌的CSF1增加導致骨吸收增加.通過抑制這一基因的表達，可以促進老年小鼠骨折部位的愈合.此外，他們還發現一種叫做骨形態發生蛋白2的SSCs刺激信號分子的產生減少，也是老年小鼠出現骨質疏松癥和骨折愈合延遲的原因之一.本文后續討論的SSCs均為小鼠的SSCs.

2 SSCs在骨骼中的分布

2.1 生長板上的SSCs

長骨的縱向生長是由生長板完成的，其中緩慢循環的細胞(靜息區)產生增殖的成軟骨細胞柱(增殖區)，然后成熟為肥大的軟骨細胞(肥大區).在肥大區的末端，生長板軟骨通過骨化過程被侵蝕并被骨和骨髓組織取代.生長發育時期骨的縱向延伸一直被認為由靜息區的軟骨祖細胞維持，但并沒有被證明.Newton等[8]通過多色報告譜系示蹤小鼠發現，在胎鼠和新生鼠中Ⅱ型膠原α1鏈陽性(Col2a1+)的軟骨祖細胞具有自我更新的能力，在次級骨化中心形成后，轉變成穩定的單向分化的增殖區軟骨細胞.此外，Mizuhashi等[9]發現一群表達甲狀旁腺激素相關蛋白(PTHrP)的細胞：在小鼠胚胎期至小鼠出生(P0)期間主要分布于生長板邊界.出生后P6至P14期間，PTHrP+細胞數量逐漸增多，并分布于小鼠長骨整個生長板的靜息區內.PTHrP+細胞不表達Col1a1但表達Sox9，是生長板靜息區內的軟骨細胞，能進一步分化成肥大軟骨細胞，并轉變成間充質前體細胞，進而分化為成骨細胞和骨髓基質細胞.雖然PTHrP細胞對成體骨的貢獻較小，但是PTHrP來源的基質細胞并不會在成年后消失，在3個月、半年、一年的生長板區域仍能追蹤觀察到PTHrP+細胞及其子代細胞.PTHrP與肥大區釋放的印度刺猬蛋白(Ihh)的相互作用，因此Hedgehog通路相關蛋白的正常表達是維持PTHrP+細胞分化命運的必要條件[10].

Gulati等[11]通過細胞表面標記定義小鼠(CD45-TER119-TIE2-ITGAV+CD200+)及人類(CD45-CD235a-TIE2-CD31-PDPN+CD73+CD164+)長骨生長板中的SSCs,雖然在分選小鼠SSCs的方法中并未特別分離生長板位置的SSCs，而是將整塊骨頭進行消化與流式分選，但是小鼠長骨分區域流式分析結果表明ITGAV特異表達于生長板，因此認為ITGAV+CD200+細胞主要位于生長板.由于這群干細胞在生長板中的具體空間位置還不清楚，所以CD200+的SSCs與Col2a1+的軟骨祖細胞是否存在關聯還有待闡明[1].此外，2021年Matthews等[12]研究報道，利用Gulati等[11]的表面標志物所鑒定出的SSCs(CD45-CD51+CD90-Ly51-CD105-CD200+，Ly51為谷氨酰氨基肽酶，自然殺傷細胞表面標志物)和BCSP(CD45-CD51+CD90-Ly51-CD105+)，在骨外膜上約10%、在骨內膜上20%～40%的細胞表達成熟成骨細胞表面標志物Col1a1(2.3 kb).由此可見CD200+細胞具有異質性，進一步細化SSCs的特異性表面標記非常必要.

出生后小鼠長骨中的SSCs可以分為兩類：早期的骨軟骨干細胞(ocSSC)和血管周骨骼干細胞(pvSSC)，兩種干細胞均具有自我更新的能力.ocSSC主要參與長骨的生長和缺損修復，在體內能分化為骨細胞、軟骨細胞和基質細胞，可以用CD45-TER119-TIE2-Thy1-Ly51-CD105-CD51+標記；pvSSC可以通過CD45-CD31-Pdgfrα+Sca1+CD24+(Pdgfrα為血小板生長因子受體α，Sca1為干細胞抗原1)區分，主要分布在骨髓中，參與造血干細胞微環境的塑造和再生，并且是骨髓內脂肪組織的來源[13].CD51是成骨細胞的特異性標志物，在長骨生長板中高表達；CD200+CD51+的干細胞能分化成BCSP，由表面標記CD51+CD105+區分；BCSP移植到腎囊腔后能夠形成沒有髓腔的骨小體，說明其多向分化的能力比ocSSC的低[14].

2.2 骨髓腔內的SSCs

骨髓腔是MSCs或骨髓基質細胞(BMSCs)主要集中的部位.MSCs屬于具有干細胞特性的一群高度異質性細胞.目前骨髓腔內多種標志物，包括Grem1(Gremlin1)、家族鋅指蛋白1(Gli1)、瘦素受體(LepR)、神經上皮干細胞蛋白(Nestin)、EBF轉錄因子3(Ebf3)、Cxcl12等已被證明可以標記MSCs.Nestin能標記成骨前體細胞，Mx1+細胞能分化為骨細胞，但是不能分化為軟骨細胞和脂肪細胞[15-16].小鼠出生后早期階段，表達Bmp拮抗劑Grem1+的細胞主要位于生長板下方的干骺端處，能夠分化為骨細胞、軟骨細胞和基質細胞，但是不能分化為脂肪細胞，在骨發育、骨重建和骨折修復中發揮作用.Grem1+細胞不表達Nestin和Cxcl12，不同于血竇血管周圍的SSCs[17].BMSCs可以被區分為干骺端間充質干細胞(mpMSCs)和髓內間充質干細胞(dpMSCs)，mpMSCs分化為成骨細胞的能力更強，并且是dpMSCs的重要來源.dpMSCs主要包括LepR+骨髓間充質細胞及其他骨髓腔內基質細胞.由Pdgfrβ+標記成年小鼠的mpMSCs具有多向分化潛能，在損傷后能分化為脂肪細胞[18].

LepR是一個能夠高度富集骨髓MSCs的標記物.Zhou等[19]研究發現：不同于Grem1+細胞，LepR+細胞出現在出生后較晚的時間點(出生后3個月達到高峰)，而且LepR+細胞一般分布在血管周圍，能分化成脂肪細胞.約0.3%的骨髓細胞是LepR+細胞，而LepR+細胞中10%具有多向分化潛能，并且占骨髓腔具有多向分化潛能細胞的94%.LepR+細胞在體外培養和體內移植實驗中能分化形成骨、軟骨和脂肪組織.LepR+細胞在出生后才逐漸增加，是成年小鼠骨髓腔大多數骨細胞和脂肪細胞的來源.生理條件下，LepR+細胞是靜息的，但在受傷后它們進入增殖狀態，包括輻照后的骨再生和骨折愈合.瘦素水平的升高具有提高骨髓MSCs成脂、降低其成骨的功能，瘦素-LepR信號通路在調節成脂和成骨中具有關鍵作用[20].Shu等[21]發現，青春期前后的骨形成分別由軟骨蛋白聚糖Acan+的生長板軟骨細胞和LepR+骨髓MSCs主導，它們分別調節骨的增長和增厚，兩種不同來源的干細胞在骨骼生長發育中具有不同分工.這種轉變從干細胞的角度解釋了哺乳動物的肢體骨骼如何在青春期后從快速的縱向生長過渡到緩慢的同位重塑.

骨髓是成年小鼠的造血器官，骨髓腔內的SSCs除分化為骨和軟骨外，還為造血細胞提供了微環境.骨內膜成骨細胞、血管周基質細胞(包括血管內皮細胞)、Cxcl12高表達的網狀細胞、LepR+的基質細胞和Nestin+的MSCs都參與造血干細胞的維持.Cxcl12在造血干細胞的維持中發揮著重要作用，Ebf3標記一部分LepR+的MSCs，這群細胞同時表達Cxcl12，參與維持造血干細胞的功能.在MSCs(Prx1+)中敲除Cxcl12會導致造血干細胞和B淋巴祖細胞的減少[22].

2.3 骨膜上的SSCs

骨膜是一種復雜的組織，排列在骨骼的外表面，由成纖維細胞、血管、神經以及內層的骨祖細胞組成.生長板在縱向骨骼延伸中起主要作用，而骨膜中的細胞在骨的發育和骨量平衡過程中有助于骨骼增厚和骨皮質的維持[23].近期，骨膜中的SSCs被相繼鑒定，更明確了SSCs在骨發育和骨修復中的作用[24].

Hedgehog通路是骨與軟骨發育中的重要通路，Gli1是Hedgehog通路的下游轉錄靶點.Gli1來源的細胞能標記生長板軟骨外膜，并分化為骨皮質和骨小梁處的成骨細胞、骨髓腔內的BMSCs和脂肪細胞.追蹤E13.5的Gli1+細胞生長至兩個月，其中約75%的Gli1+細胞同時表達LepR，提示胚胎起源的Gli1+細胞是小鼠成年后骨髓腔內LepR+細胞的部分來源；但是因為在生長板中也有Gli1的表達，所以不能確定這部分Gli1細胞是否完全來源于骨膜[25].Gli1+細胞與Grem1+細胞類似，提供了年輕小鼠骨生長所需的干細胞，但其并不是長期維持骨平衡的干細胞類型.Axin2是Wnt的下游蛋白，與Gli1類似，也能標記早期骨膜上的SSCs[26].配對相關同源基因1(Prx1)能標記四肢骨的MSCs，從骨膜分離出的Prx1+細胞表達多個BMSCs的標志物，如Pdgfrα、Grem1、Cxcl12和Nestin.將骨膜中的Prx1+細胞移植到骨折損傷處，Prx1+細胞能夠分化成祖細胞，具有自我更新的能力[27].Y染色體性別決定區(SRY)轉錄因子Sox9是成年小鼠骨膜中干細胞的標志物，在骨折損傷時，Sox9+細胞被誘導分化成軟骨，參與骨損傷的修復.

在骨膜上，還存在一群由α-肌動蛋白(α-SMA，別名Acta2)標記的長期的成骨成軟骨祖細胞.α-SMA+細胞在骨折愈合過程中發揮重要作用，其被激活并分化為軟骨細胞和成骨細胞.在骨髓腔和骨內膜也存α-SMA標記的成骨成軟骨祖細胞，但是大部分α-SMA+細胞還是集中在骨外膜上[28-29].α-SMA+細胞是具有異質性的一群細胞，其中大部分為表達CD51和CD90的SSCs[12].另一個骨膜SSCs的重要標志物是組織蛋白酶K(Ctsk).傳統認為Ctsk是骨髓腔內破骨細胞的標志物，近期發現Ctsk還能標記骨膜來源的中胚層間質前體細胞，主要參與長骨的膜內成骨，在骨皮質的增厚中發揮重要作用.Ctsk+細胞不僅標記長骨的骨膜，還標記顱骨的骨膜.顱骨的形成主要依賴膜內成骨，這也驗證了Ctsk+細胞是參與膜內成骨的一群成骨前體細胞.骨膜中分離的Ctsk+細胞具有自我更新的能力，并且能在體外培養中分化為骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞.Ctsk+細胞能分化為骨皮質中的成骨細胞，但是不分化為骨髓中的成骨細胞[30].然而，在骨折損傷的修復中，Ctsk+細胞會發生轉變，通過軟骨內成骨的方式參與骨折的修復[30].

2.4 SSCs的時空特異性

SSCs在不同部位的骨骼上表達不一樣的標志物，特定標記的SSCs在骨骼發育的不同階段會出現表達峰值的交替變化，可見SSCs在時間和空間上均有其自身的規律.成骨相關轉錄因子Osx+(Osterix陽性)干細胞或前體細胞則隨著骨骼發育不同階段出現這類表達峰值交替變化的現象，在胚胎期，Osx+細胞是骨髓腔內新形成骨的來源，在小鼠成年后被替代；在新生小鼠階段，Osx+細胞標記骨髓腔中的成骨細胞和長期存在的基質細胞；成年小鼠體內的Osx+細胞在骨組織損傷時參與組織的修復[31].Hox11只特異性標記了Zeugopod(尺骨和橈骨、脛骨和腓骨)骨髓腔內的MSCs和骨外膜上的成體SSCs，而在股骨、肱骨等其他部位，骨髓腔內的MSCs則表達其他的Hox家族基因[32].

綜上所述，目前研究發現的SSCs主要分布于長骨內的生長板、骨髓腔和骨膜上，分別由不同的標志物標記(圖1).

圖1 SSCs在長骨中的分布

3 SSCs在骨修復中的應用

目前，人類骨骼系統疾病的治療策略主要是以結構重建為基礎，通過手術治療恢復軀體正常的運動結構或解剖結構，以達到良好的運動功能為最終目的.干細胞具有自我更新能力和多向分化潛能，已有多種干細胞用于臨床研究，如BMSCs、脂肪干細胞、臍帶間充質干細胞等.對于SSCs的分類和功能，其基本定義、分化等級及骨內的組織分布情況已逐步被探明，然而SSCs的功能亟待闡明.諸多基礎研究已表明SSCs在骨骼發育及骨修復中扮演著重要的角色.研究表明SSCs與年齡相關性軟骨再生能力關系密切.通過成年小鼠關節軟骨的微骨折模型實驗，證實了微骨折能夠激活SSCs參與軟骨修復過程，并且小鼠和人類SSCs活性隨著年齡增加，進行性喪失與軟骨生成減少呈正相關[33].在急性骨損傷中，小鼠BCSP表達CD49f并被激活以促進骨修復.相比之下，這些骨折誘導產生的小鼠BCSP在未受傷的骨骼中并不存在[34].在人骨異種移植模型(在免疫缺陷小鼠上移植了胎兒帶完整骨膜的指骨移植物)上評估SSCs的能力，研究發現人類SSCs在急性骨損傷的損傷部位明顯增加，證實了人類SSCs對骨骼損傷的再生能力[2].在糖尿病患者膝關節的標本中，觀察到Ihh基因的表達下降，在小鼠中通過Ihh的外源性遞送來挽救后誘導SSCs生成可促進骨愈合[35].而在小鼠下頜牽引成骨過程中，黏著斑激酶(FAK)通過驅動SSCs再生促進骨修復；隨著FAK的抑制，SSCs驅動的骨再生能力嚴重受損，導致纖維瘢痕組織代替骨的生成[36].這些研究強調了SSCs在骨修復中的重要性.

4 總結與展望

SSCs具備自我更新能力，只發育為骨和軟骨，而非脂肪、肌肉或其他組織，在臨床骨科疾病的治療中具有很大的潛力.骨不連和骨缺損是骨科治療中常見的棘手問題，目前的方案包括常規穩定手術治療和非手術治療，但傳統游離植骨術需要經過漫長的爬行替代過程，而器械導致的骨面加壓或擴髓則可能會進一步增加感染風險.近年隨著組織工程和分子生物學臨床應用的飛速發展，采用分子生物學方法治療骨不連和骨缺損的研究備受學者關注[37].與傳統的高分子材料或金屬材料相比，BMSCs聯合復合支架載體具有較高的天然骨仿生性、力學性能和低免疫排斥反應，成為骨再造組織或器官的臨床研究重點[37].研究顯示，BMSCs聯合殼聚糖-P24/羥基磷灰石復合材料支架可提高材料與骨質的整合修復效率[38].三維打印仿生羥基磷灰石支架的納米結構和孔結構可增強BMSCs向成骨細胞分化的誘導能力，進而獲得優異的骨傳導性能和骨再生能力[39].作為骨組織的干祖細胞，SSCs聯合低免疫排斥的生物支架將可能是修復骨不連和骨缺損的最理想方式之一.

近年組織工程和干細胞分子生物技術的興起，為關節軟骨的修復再生開辟了新途徑.目前軟骨組織工程多依靠BMSCs聯合使用細胞外基質結構，如BMSCs聯合聚乙烯醇/聚己酸內酯用于修復鼠全層軟骨缺損，BMSCs薄板與聚乳酸乙醇酸/MSCs聯合應用可增強軟骨再生能力，提升再生軟骨與周圍軟骨的整合效率[40-41].SSCs的自我更新能力和成軟骨潛能使SSCs在聯合低免疫排斥生物支架材料修復軟骨缺損疾病中扮演重要角色，將給關節鏡和再生醫學領域帶來改變.椎間盤退行性疾病源于遺傳學、機械力學和椎間盤微環境的改變，是脊柱外科常見的高發病率疾病，也是下腰痛的主要原因.目前椎間盤退變的治療方案有非手術治療和手術治療，但均未能改變椎間盤退變的病理狀態.干細胞組織工程為椎間盤退變治療提供了新方案：BMSCs復合葡萄聚糖-明膠水凝膠裝載轉化生長因子β3(TGF-β3)的生物支架可誘導BMSCs向髓核樣細胞分化，并檢測到細胞外基質基因的表達[42].另外，京尼平交聯復合生物支架負載脂肪干細胞同樣可誘導干細胞髓核樣分化，加強了椎間盤的再生能力[43].在臨床治療上，采用BMSCs髓核內植入技術治療10例下腰痛患者，獲得較好的臨床預后，也證實了干細胞干預椎間盤疾病的可行性和可靠性[44].與BMSCs相比，SSCs是一類異質性較低、表面生物標志物可靠且生物學特性穩定的干細胞群落，可以聯合使用促分化因子或生物組織工程，以達到對椎間盤退行性疾病損傷修復的高效治療.

總之，目前的研究結果已經初步按空間分布將SSCs劃分成生長板上、骨髓腔內和骨膜上3類，并進一步確認了SSCs及成骨祖細胞的分化階段細胞表面標記物的變化.然而，不同的SSCs在骨骼內的生物學作用還有待進一步闡明.另外，進一步完善SSCs的鑒定和功能，并闡明SSCs在細胞分子和組織結構層面的調控作用機制，有望將其與傳統療法相結合，為干細胞治療提供新策略，為人類的健康和生活帶來新希望.