浙江省不同地區野生鼠茅遺傳多樣性研究

劉本同，王麗玲，王衍彬，黃旭波，秦玉川

（浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023）

鼠茅Vulpia myuros為越年生禾本科Poaceae 鼠茅屬Vulpia植物，每年9 月萌發，翌年6 月死亡，留下的種子可于當年9 月萌發。目前，鼠茅主要用于果園抑草[1]和綠肥種植[2-3]，主要分布在江蘇、浙江、廣西等地，具有較高的經濟價值。前期研究表明，不同產地的鼠茅在生理特性方面存在差異，特別是耐寒、耐旱性方面存在差異。近年來，對于鼠茅的研究也多集中在種植、生理特性等方面[4-7]，關于用分子標記技術研究鼠茅遺傳多樣性及遺傳結構的報道幾乎沒有。與其他分子標記技術相比，簡單序列重復區間擴增多態性分子標記（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是顯性標記，具有穩定性好、多態性高、簡便及易操作等優點，被視為理想的遺傳標記方法[8-10]。目前，ISSR 已在多種動植物的遺傳多樣性、親緣關系分析、種質資源鑒定、基因定位和遺傳圖譜構建等研究方面得到應用[11-14]。本研究應用ISSR 分子標記法分析來源于浙江省內及市售日本種的鼠茅遺傳多樣性水平及親緣關系，以期對鼠茅資源的保護和開發等方面提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2020 年4—5 月，采集浙江省各市的鼠茅的地上部分，將采摘的鼠茅存放于裝有干燥硅膠的密封袋中備用。日本種質購于種子市場，為日本鼠茅品種‘雪印’。共26 個樣品，樣品采集信息見表1。

1.2 試劑

TIANamp Genomic DNA Kit，天根生物科技（北京）有限公司；TS-GelRed 核酸染料（10 000×水溶液），北京擎科新業生物技術有限公司；Regular Agarose，西班牙Biowest 公司；50×TAE Tris-乙酸電泳緩沖液，福州Phygene 生物科技有限公司。

1.3 供試儀器

DK-S26 電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；FRESCO 21 微量冷凍離心機、NanoDrop2000 超微量分光光度計，美國Thermo scientific 公司；Life ECO 擴增儀，杭州博日科技有限公司；DYY-12C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Bio-Rad 凝膠成像系統，美國伯樂公司。

1.4 引物序列

供試引物所采用的ISSR 擴增引物信息見表2，共15 條引物。供試引物委托北京擎科新業生物技術有限公司合成。

表2 最優ISSR 引物序列Table 2 The optimal ISSR primer sequence

1.5 DNA 的提取及檢測

取待提取鼠茅葉片，用無菌水清洗數遍，用濾紙吸干水分，加研磨珠在研磨機上徹底磨碎。基因組DNA 的提取參照天根TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒操作說明書。利用NanoDrop 2 000 超微量分光光度計對樣品基因組DNA 進行核酸純度及濃度的檢測，于-20℃冰箱儲藏備用。

1.6 PCR 引物的篩選、ISSR-PCR 擴增及檢測

參考加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100 條ISSR 引物序列，隨機選取2 個鼠茅樣品模板DNA，采用最優ISSR-PCR 體系中的擴增條件，從ISSR 引物中篩選出15 條反應體系較穩定、擴增條帶較清晰且多態性較多的引物，最優引物序列見表2。PCR 反應體系為20 μL，含有DNA 樣品1 μL(40 mg·L-1)、引物1 μL，2×TSINGKE Master Mix 10 μL，加ddH2O 至體積20 μL。反應程序：94℃預變性5 min，95℃變性1 min，52～ 57℃退火1 min，72℃總延伸5 min，共35 個循環，4℃保存。PCR 擴增反應在LifeECO 基因擴增儀（杭州博日）上進行。PCR產物在質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，TS-GelRed 核酸染料染色，1×TAE 電泳緩沖液中電泳40 min，電壓為130V。Marker 為2 000 bp。電泳后，在Bio-Rad 凝膠成像儀上拍照并保存DNA 檢測結果。

1.7 數據分析

根據樣品的ISSR 擴增譜帶信息，按照鄒喻萍等[15]制定的標準，以擴增條帶有計為“1”，無計為“0”。用Image Lab 軟件對圖譜上的條帶進行人工標記，并導出為0-1 矩陣的數據。用NTSYS 2.10 軟件對來源于不同地區的鼠茅進行個體間的非加權成對算術平均法（UPGMA）聚類分析，使用軟件中的SimQual 程序計算樣品間的Dice 遺傳相似系數，用SAHN 程序進行UPGMA 聚類分析，通過Tree plot 模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 I SSR-PCR 擴增結果

用篩選出的15 條引物對采集的25 個樣品和1 個日本種質進行擴增，共擴增出87 條條帶，在多態性條帶中其有效條帶數為83 條，有效條帶數占總條帶數的95.40%。15 條引物擴增出的條帶數量均為2～ 12 條，其中，引物848 擴增出的條帶數量最多，為12 條；PCR 擴增結果見表3。引物835 對鼠茅的PCR 擴增結果見圖1。

圖1 引物835 對鼠茅的PCR 擴增結果Figure1 PCR amplification of primer 835 on V.myuros

表3 鼠茅ISSR 標記的多態性Table 3 Polymorphism of ISSR markers in V.myuros

2.2 遺傳相似性分析

將15 條引物擴增出的條帶作為原始矩陣，利用NTSYS-pc 軟件計算26 份鼠茅種質間的Dice 遺傳距離，結果見表4。由表4 可知，26 份種質之間的遺傳距離均介于0～ 0.707，平均為0.457。其中，浙江省內種質間遺傳距離最大的為1 號和3 號、3 號和12 號，其遺傳距離均為0.679，表明兩者間的親緣關系最遠；遺傳距離最小的為7 號和13 號，其遺傳距離為0，說明這兩者親緣關系非常近，可能來源于同一祖先。此外，日本種質26號與浙江種質的鼠茅遺傳距離都較遠，其中與3 號的遺傳距離最大，為0.707，與24 號和25 號的遺傳距離最近，均為0.555。這表明浙江的這25 份鼠茅種質為浙江特有種質，均非人工播種的日本種質。26 份試樣間的遺傳距離詳見表4。

2.3 聚類結果分析

使用Ntsys 2.1 軟件對26 個鼠茅樣品基于遺傳相似性系數進行UPGMA 聚類，聚類結果見圖2?由圖2 聚類結果顯示，在遺傳相似系數0.63 處劃分，26 個樣品可聚為2 類，其中，來自麗水的3 號種質單獨為一類，其余25 個種質為一類；在遺傳相似系數0.78 處，可將第一類的25 份樣品進一步細分為兩類，其中，日本種質26 號單獨為一類，其余24 份樣品聚為一類；相同產地的鼠茅聚類關系都較近，如12 號、13 號、14 號來自臺州的鼠茅種質均在同一個分叉上，4 號和5 號來自麗水的鼠茅種質也聚集較近，也有少數同一產地的鼠茅種質沒有聚在一類，如來自杭州的23 號、24 號種質聚類較遠，說明兩者的親緣關系較遠?結合產地聚類和個體聚類結果可知，除3 號種質外，浙江省內鼠茅的親緣關系都較近，且相互交叉。這與遺傳距離分析結果一致，鼠茅不同種源的基因交流程度較高，遺傳分化較小。

圖2 26 份種質的UPGMA 遺傳聚類圖Figure 2 Dendrogram constructed for 26 germplasms based on UPGMA

3 討論

本研究利用ISSR 分子標記方法對浙江省內25 份不同地理來源的鼠茅和1 份從市場采購的日本種質進行遺傳多樣性分析?由遺傳多樣性分析結果可知，鼠茅具有豐富的遺傳多樣性。遺傳距離是用來比較群體或個體間親緣關系遠近的度量參數，距離越小，說明親緣關系近，遺傳背景的一致性越強，由遺傳距離進行親緣關系分析，26 份鼠茅種質之間遺傳距離為0～ 0.707，其遺傳距離總體來說比較小，表明浙江省內鼠茅個體間的親緣關系較近；進一步的聚類結果分析可知，來自衢州的7 號種質和來自臺州的13 號種質，以及來自臺州的14 號種質和

來自寧波的15 號種質的親緣關系較近，表明這些地區鼠茅種質的親緣關系較近，遺傳背景較為一致。同時，從聚類關系圖也可看出，同一個地區的鼠茅并未聚集在一起，如來自寧波的15～ 19 號種質，分布在聚類圖的各分叉上，這可能與鼠茅的繁殖方式相關，并與基因的交流程度有關。此外，來自麗水的3 號種質在聚類圖上單獨聚為一類，這說明該鼠茅種質的遺傳上與其他種質有較大差異，在后續的育種等方面值得關注。

ISSR 分子標記技術能夠揭示鼠茅不同種質間的遺傳差異及親緣關系，雖然目前對鼠茅種質間的遺傳多樣性的研究較少，但在其他物種中得到了很好運用。如：李曼等[16]采用ISSR 分子標記對39 個不同產地的牛膝Achyranthes bidentata種質進行聚類分析，將其分為2 大類群6 個亞群，這說明牛膝具有豐富的遺傳多樣性；李勇慧等[17]采用ISSR 分子標記法對洛陽地區35 個牡丹Paeonia suffruticosa品種進行了遺傳多樣性分析，結果表明，35 個牡丹品種的遺傳多樣性豐富，可分為5 大類，為合理利用牡丹種質資源提供分子水平的研究基礎?蔣明等[18]對8個居群共125份日本莢蒾Viburnum japonicum樣品進行了ISSR遺傳多樣性分析，聚類分析結果表明，同一地理來源的日本莢蒾大多聚為一類，呈一定的地域分布規律，日本莢蒾遺傳多樣性水平高，但主要存在于居群間，島嶼之間的地理隔離可能是遺傳分化的主要原因。因此，本文通過ISSR 分子標記方法對鼠茅親緣關系鑒定，結合不同鼠茅的生理生化特征，可為鼠茅規范化種植及資源保護開發等提供科學依據?

4 結論

本研究對浙江地區及市售日本種質共26 份鼠茅樣品進行ISSR 遺傳多樣性分析。用篩選出的15 條引物對26 份種質進行擴增，共擴增出87 條條帶，其中有效條帶數為83 條，占總條帶數的95.40%；15 條引物擴增出的條帶數量均為2～ 15 條，其中，引物848 擴增出的條帶數量最多，為12 條。26 份種質之間的遺傳距離均介于0～ 0.707，平均為0.457，其中，浙江省內種質間遺傳距離最大的為1 號和3 號、3 號和12 號，其遺傳距離均為0.679，表明兩者間的親緣關系最遠，遺傳距離最小的為7 號和13 號，其遺傳距離為0；此外，日本種質26 號與浙江種質的鼠茅遺傳距離都較遠，其中與3 號的遺傳距離最大，為0.707。UPGMA 聚類結果表明，在遺傳相似系數0.63 處劃分，26 個樣品共聚為2 類，其中，來自麗水的3 號種質單獨為一類，其余25 個種質為一類；在遺傳相似系數0.78 處，可將上述第一類的25 份樣品進一步細分為兩類，其中日本種質26 號單獨為一類，其余24 份樣品聚為一類。同一地理來源的鼠茅大多聚為一類，呈現一定的地域分布規律，但也不僅僅局限于地域聚類，不同地域遺傳相似度較高，鼠茅遺傳分化程度也不高。以上研究結果，可以為鼠茅的異地種植、資源保護提供理論依據。