兩種鎘積累型小麥根際微生物群落結構及功能多樣性

孫樂妮,吳兵兵,徐志豪,李澤龍,張勝全,楊恩東,周佳慧

1 安徽農業大學生命科學學院,合肥 230036 2 北京市農林科學院北京雜交小麥工程技術研究中心,北京 100097

隨著工業化的發展,礦山開采、燃煤發電和工業廢水排放等大量工業活動,導致土壤重金屬污染日益嚴重,直接或間接地影響了土壤質量[1]。2014年,國家發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示,我國土壤總體污染較為嚴重,主要受到了Cd、Cr、Pb和Cu等重金屬污染[2]。重金屬鎘毒性較大,遷移性強,對于農作物的生長發育有毒害作用,進而通過食物鏈直接或間接影響人體健康。長期食用含Cd的食物,會導致人體代謝異常,鈣及磷元素缺失,危害人體肺和肝等重要器官,影響身體健康。

小麥是世界上最主要的糧食作物之一,在世界農業生產中占據重要地位。農田重金屬污染對小麥安全生產已產生潛在危害,一些地區小麥籽粒重金屬含量存在超過中國國家食品安全標準(GB2762—2017)現象[3—4]。研究者們發現不同小麥品種耐受重金屬及吸收積累重金屬能力存在差異[5—8]。利用小麥吸收積累重金屬在不同品種間的差異性,篩選用于作物安全生產的低積累型品種,是應對農田重金屬污染的解決策略之一[9]。

根際微生物作為土壤-植物生態系統的重要連接載體,不僅參與土壤物質循環、保持土壤肥力,而且對土壤中重金屬的遷移、轉化以及植物生長發育、對環境的適應性起重要作用。接種根際微生物Streptomycespactum和Pseudomonasaeruginosa能通過活化或鈍化土壤重金屬,改變重金屬的生物有效性,提高或降低小麥對重金屬的吸收[10—11]。接種微生物也能調節小麥生理生化特性,改善對不良環境的抗氧化脅迫能力[12—13]。由此可見,小麥根際微生物菌群在提高或阻控小麥吸收重金屬、增強環境適應性方面發揮重要作用,有必要加強小麥根際微生物菌群研究,以加深對微生物-小麥相互作用機制的理解。小麥根際微生物群落結構雖已見報道,但相關研究僅限于單一品種或重金屬脅迫對單一品種根際微生物的研究[14—16]。隨著作物品種在安全生產中重要作用的充分體現,不同積累型作物重金屬吸收富集能力、亞細胞分布、根際化學特點比較已見報道[7,17—18],但重金屬高低不同積累型小麥根際微生物群落結構與功能研究鮮見報道。本研究采用菌株分離培養技術結合 Biolog微平板技術分析兩種不同鎘積累型小麥根際微生物群落結構與功能多樣性差異,研究結果有利于深入理解鎘低積累型小麥根際微生物菌群特征,為在中低污染土壤中利用微生物調控小麥安全生產提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

重金屬Cd污染土壤采自安徽廬江岳山礦區周邊農田,非污染土壤采自安徽農業大學農萃園農田。小麥品種為鎘高積累型冀 5265(JI5265)和鎘低積累型濟麥22(JM22)[8]。

LB 培養基:蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl10 g,蒸餾水1000 mL,瓊脂20 g,pH 7.2。重金屬抗性細菌篩選固體培養基：分別配制重金屬母液和 LB 培養基,單獨滅菌后,取不同量重金屬母液加入到 LB 培養基中,得到不同濃度梯度的重金屬抗性固體培養基。脲酶培養基[19]：蛋白胨1 g,葡萄糖1 g,氯化鈉5 g,磷酸二氫鉀2 g,酚紅0.012 g,2%尿素,蒸餾水1000 mL,瓊脂20 g,pH 7.0。其中,尿素水溶后過濾除菌加入滅菌后的培養基。

1.2 小麥盆栽試驗

將土壤風干過篩后分別裝入盆中(h18 cm×Φ26 cm),每盆裝土3.0 kg。盆栽試驗設置4個處理：污染土濟麥22(CJM)、污染土冀 5265(CJI)、非污染土濟麥22(NJM)和非污染土冀 5265(NJI),每個處理設置3個重復,共12盆。每盆播種12粒小麥種子,各盆隨機放置于室外。待小麥長至分蘗期,采收小麥,收集根際1—2 mm范圍內的根際土,用于根際土壤微生物分析。

1.3 根際可培養細菌分離及數量測定

取小麥根際土壤各1 g,分別加入到裝有99 mL無菌蒸餾水的三角瓶中,放置于28℃搖床內振蕩30 min。取樣做十倍梯度系列稀釋,得到10-2,10-3,10-4,10-5土壤懸液,分別取100 μL稀釋液涂布在不含Cd2+和含Cd2+濃度為25 mg/L(CdCl2)的LB固體平板上,置于28℃生化培養箱中培養72 h后對平板上菌落進行計數,并計算每克土壤中具有抗Cd細菌數量和總細菌數量。挑取高稀釋度平板上的優勢菌落進行多次劃線分離純化,并將菌種保存于-80℃備用。

1.4 菌株16S rDNA序列分析

對分離菌株參照《DNA-EZ Reagents V All-DNA-Fast-Out》試劑盒說明書提取細菌基因組DNA,保存于-80℃冰箱。PCR反應參考文獻[20]方法進行。正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物為1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′,以細菌總DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系(50 μL)：10× buffer 5 μL,25 mM MgCl23 μL,上游引物27F和下游引物1492R各2 μL,2.5 mM dNTP 1 μL,Taq DNA polymerase 1 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O補足至50 μL。取2 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產物送上海生工進行測序。將序列提交NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast比對,確定物種信息。序列用 BLAST程序 與 GenBank 數據庫中的典型菌株序列進行比對分析,選取相似性較高的典型菌株 16S rDNA 序列,經 Clustal X1.83 進行自動排序比對后,用MEGA7.0 軟件 Neighbor-joining 法構建系統發育樹。

1.5 根際優勢可培養細菌生物學特性

菌株脲酶活性測定：將目標菌株劃線接種到脲酶培養基上,28℃培養48 h后觀察現象,若菌苔周圍培養基變紅,則該菌株產脲酶活性為陽性[19]。菌株的鎘抗性測定：將菌種接種到不同重金屬濃度的固體培養基上(重金屬終濃度如下：Cd2+50、100、200 mg/L),28℃培養3—5 d,觀察菌株是否能夠生長,若能生長,則該菌株對重金屬鎘有抗性[21]。

1.6 Biolog-Eco 微平板分析

利用Biolog-Eco微平板法評價根際土壤微生物的功能多樣性。將10-3根際土壤稀釋液接種Biolog-Eco生態測試板,每孔接種150 μL,每個樣品三個重復,加蓋置于 25℃的培養箱中保濕避光培養8 d,定時用酶標儀讀取590 nm吸光值。

Biolog-Eco微平板法測定的每孔平均顏色變化率(average well color development,AWCD)是土壤微生物代謝活性的重要指標。土壤微生物群落功能多樣性指數采用Shannon-Wiener 指數(H)、Mc Intosh 指數(U)、Simpson指數(D)和Pielou 指數(J)。

H=-∑PilnPi

J=H/lnS

式中,Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板所有相對吸光值總和的比值(Ci-R)/∑(Ci-R)；S為被利用的碳源總數,即Ci-R>0的孔的數目；ni為第i孔的相對吸光值,即(Ci-R)；Ci為第i個非對照孔的吸光值；R為對照孔的吸光值；n為培養基碳源種類數31。

1.7 數據處理

數據采用Microsoft Excel Office 2019進行處理并作圖；采用SPSS17.0進行數據單因素方差分析,Duncan 檢驗方法進行數據差異顯著性分析(P<0.05 差異顯著)。采用Canoco for Windows 5.0軟件,利用培養120 h AWCD值對不同土壤中小麥根際微生物碳源代謝多樣性進行主成分分析(PCA)。

2 結果與分析

2.1 根際可培養細菌數量

不同小麥品種根際細菌數量如表1所示。污染土壤和非污染土壤中濟麥22根際總細菌數量分別是冀5265的6.4倍和1.57倍。污染土中濟麥22抗Cd細菌數量最高,為8.25×106cfu/g,占總細菌數的51%。污染土壤中濟麥22根際總細菌數量和抗Cd細菌數量均顯著高于冀5265(P<0.05),而兩者于非污染土壤中無顯著差異。對不同土壤而言,污染土中濟麥22根際總細菌數量、抗性細菌數量以及抗性細菌比例均顯著高于非污染土；污染土中冀5265根際抗性細菌數量以及抗性細菌比例均高于非污染土。鎘污染土壤中抗性細菌數量以及抗性細菌比例均明顯高于非污染土壤。

表1 不同土壤栽培下小麥根際細菌數量Table 1 The number of rhizosphere bacteria in wheat under different soil cultivation

2.2 根際優勢可培養細菌鑒定及生物學特性

采用稀釋涂布平板法分離獲得小麥根際優勢細菌總計34株(表2),經鑒定屬于4個菌門、9個屬,產脲酶細菌14株,占總細菌數41.2%,鎘抗性細菌(200 mg/L)7株,以鄰接法構建的系統發育樹如圖1。研究發現,污染土濟麥22的根際細菌鑒定為Actinobacteria 門Arthrobacterspp.(4株)、Pseudarthrobacterspp.(2株)、Paenarthrobactersp.(1株)和Firmicutes門Bacillusaerophilus(1株)、Bacillusmegaterium(1株)和Bacillussp.(1株),其中產脲酶菌株7株,鎘抗性細菌5株；污染土冀5265小麥根際細菌為Actinobacteria 門Streptomycesspp.(3株)、Microbacteriummarinum(1株)、Pseudarthrobactersp.(1株)以及Alphaproteobacteria門Agrobacteriumspp.(2株)和Firmicutes門Bacillussp.(1株),其中產脲酶菌株2株,鎘抗性細菌2株;非污染土濟麥22的根際細菌為Bacillusaerophilus(4株)、Bacillussp.(1株)、Agrobacteriumspp.(2株)、Ensiferadhaerens(1株),產脲酶菌株4株；非污染土冀5265小麥根際細菌為Bacillusaerophilus(4株)、Bacillussp.(1株)、Agrobacteriumspp.(2株)和Pantoeadispersa(1株),產脲酶菌株1株。

圖1 小麥根際細菌16S rRNA 基因系統發育樹Fig.1 Neighbor-Joining tree shows the phylogenetic relationships of wheat rhizobacteria based on 16S rRNA gene sequences分支點數字為 Bootstrap 值,代表分類單位被聚在一起的幾率；比例尺顯示水平線的長度,代表堿基替換數；括號里的內容為GenBank 登錄號

表2 分離菌株的鑒定及生物學特性Table 2 Identification and biological characteristics of isolated strains

小麥根際微生物優勢菌存在品種間和土壤間差異。污染土中濟麥22根際細菌以放線菌門節桿菌屬(Arthrobacter)和厚璧菌門芽孢桿菌屬(Bacillus)為主,冀5265根際優勢菌以放線菌門鏈霉菌屬(Streptomyces)為主,污染土中兩者根際優勢菌群差異較大,而非污染土中兩者根際優勢菌群較相似。污染脅迫使小麥根際優勢菌發生變化,但都以放線菌門為主。污染土中濟麥、冀麥及非污染土中濟麥、冀麥根際細菌產脲酶比例分別為70%、25%、50%、12.5%。濟麥根際產脲酶細菌比例高于冀麥,污染土小麥根際產脲酶細菌比例高于非污染土根際。污染土根際細菌中38.9%(7株)菌株耐受200 mg/L Cd,而非污染土根際細菌菌株均不耐受200 mg/L Cd。污染土濟麥根際與冀麥根際耐受200 mg/L Cd的菌株分別占50%和25%。根際產脲酶細菌和重金屬抗性細菌受小麥品種和土壤污染程度影響。

2.3 小麥根際微生物群落碳源代謝利用能力分析

2.3.1碳源代謝活性動力學分析

平均顏色變化率(AWCD)表示土壤微生物群落對31種碳源的利用能力和代謝活性變化,體現了土壤微生物群落生理功能多樣性。由圖2可知,不同土壤栽培的小麥根際微生物AWCD值隨著培養時間的延長而逐漸升高。24 h之前AWCD值幾乎保持不變,表明碳源沒有被微生物利用。在24—120 h之間AWCD值增長速率較快,表明碳源被快速利用,微生物代謝活性明顯增強。120 h以后增長速率減緩并于144 h后趨于穩定。對于小麥品種濟麥22,24 —120 h污染土壤AWCD值高于非污染土壤,而144 h以后非污染土AWCD值高于污染土。濟麥22的污染土壤AWCD值與非污染土壤有顯著差異(P<0.05),表明同一種小麥,根際微生物組成會受栽培土壤影響。在整個培養過程中,冀5265的污染土與非污染土AWCD值無顯著差異,說明這種小麥的兩種根際土壤微生物碳源代謝能力幾乎相同,幾乎不受土壤類型影響。污染土壤和非污染土壤中濟麥22 AWCD值均顯著大于冀5265,表明濟麥22根際微生物對碳源的利用能力大于冀5265,濟麥22根際微生物代謝活性更強。

圖2 不同土壤栽培下不同小麥根際微生物群落平均顏色變化率AWCD隨時間的動態變化Fig.2 Dynamics of AWCD of different wheat rhizosphere microorganisms in different soils

2.3.2碳源類型利用特征

將Biolog-Eco板31種碳源分為6大類,根據120 h 測定的31個孔AWCD值進行碳源利用分析。由圖3可知,污染土壤栽培的濟麥22根際微生物對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類、胺類6類碳源的利用強度均很高,且都顯著高于污染土壤中冀5265(P<0.05),其中,對胺類化合物的利用差異極顯著(P<0.001)。非污染土中濟麥22僅對羧酸類碳源利用強度顯著高于冀5265,而其它碳源間無顯著差異,說明非污染土壤中濟麥22根際微生物菌群與冀5265較相近。對于濟麥22,污染土壤中對各類碳源利用強度均高于非污染土壤,且在氨基酸類、酚酸類、多聚物類和胺類這4大類碳源上存在顯著差異(P<0.05)。冀5265在污染土壤中對酚酸類利用強度與非污染土壤存在差異,其他各類碳源利用強度與非污染土壤無差異。同一品種小麥根際微生物對不同碳源的利用程度不同,對碳源利用水平總體上較高的是碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類和多聚類。僅污染土壤中濟麥22根際微生物對胺類有較高利用,而冀5265對胺類化合物利用基本趨于零。根際微生物對碳源利用能力不同可以反映根際微生物群落結構不同。

圖3 不同土壤栽培下小麥根際微生物對六類碳源利用強度Fig.3 Utilization intensities of six types of carbon sources by wheat rhizosphere microorganisms under different soil cultivation同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著

2.3.3根際微生物群落代謝功能多樣性指數

Mc Intosh 指數(U)用于描述基于群落物種多維空間上Euclidian距離的多樣性指數,Simpson指數(D)用于評估某些常見物種的優勢度,Shannon-Wiener 指數(H)和Pielou指數(J)分別用于評估微生物群落的物種豐富度和物種均勻度。由表3可知,在兩種土壤中濟麥22的根際微生物Mc Intosh 指數、Shannon-Wiener 指數、Simpson指數均顯著高于冀5265(P<0.05),表明小麥根際微生物物種豐富度和優勢度受到不同積累型小麥品種影響。濟麥22的Mc Intosh 指數、Shannon-Wiener 指數、Simpson指數均表現為污染土壤明顯高于非污染土壤,而冀5265則無顯著差異。Pielou指數在各處理間無顯著差異,說明不同積累型小麥根際微生物均一性相似。冀5265根際微生物的Mc Intosh 指數(U)、Shannon-Wiener 指數(H)、Simpson指數(D)、Pielou指數(J)均為最小,表明非污染土壤栽培的冀5265根際微生物均勻度和豐富度最小。

表3 不同土壤栽培下不同小麥根際微生物120 h AWCD和多樣性指數Table 3 120 h AWCD and diversity index of wheat rhizosphere microorganism under different soil cultivation

2.4 根際微生物碳源利用主成分分析

為了進一步明確不同小麥根際微生物群落功能和結構的差異,研究選取120 h各處理根際微生物對31種碳源的AWCD數據進行主成分分析。由圖4可知,第一主成分(PC1)貢獻率為37.85%,第二主成分(PC2)貢獻率為15.53%。四組處理中,CJI和NJI點陣主要集中于一三側象限,CJM和NJM點陣主要分布于右側象限,表明小麥品種明顯影響菌群結構。NJM和NJI點陣主要集中于第一象限,相距較近,表明在非污染土中濟麥22與冀5265菌群碳源代謝相似、菌群較相近；污染土壤中CJM與CJI分別偏離NJM和NJI點陣,表明污染土壤兩種小麥根際微生物菌群與非污染相比均發生變化。

圖4 基于小麥根際微生物碳源利用的主成分分析 Fig.4 Principal components analysis (PCA) based on carbon source utilization of rhizosphere microorganism in wheat

3 討論

土壤微生物是土壤生態系統中物質轉化的重要驅動力,對植物生長發育具有重要作用。重金屬污染對根際微生物的影響是復雜的,它會打破植物根際原有的微生物物種生態平衡,一方面會使不適應重金屬的物種數量減少,另一方面會使適應生長的微生物種類數量增多[22—23]。本研究發現污染土壤中低積累型濟麥22根際總細菌數量、抗Cd細菌數量顯著高于非污染土壤濟麥22和污染土壤高積累型冀5265,同時濟麥22 的AWCD值高于冀5265,這表明污染土壤中低積累型小麥根際細菌數量多、代謝活性更強,重金屬污染刺激了濟麥22根際細菌數量增長。產生這一結果的原因可能是,一方面重金屬對根際微生物物種的選擇性刺激或抑制作用,另一方面高低不同積累型小麥根系分泌物種類和數量存在差異[18],導致了明顯不同的根際效應。低積累型濟麥22根際微生物的轉變可能更有利于該小麥適應重金屬污染環境。龔玉蓮等[24]研究發現高低鎘積累蕹菜根際微生物群落結構和功能差異顯著,低積累型蕹菜QLQ根際微生物群落代謝活性明顯高于高積累型蕹菜T308,這與本研究結果相一致,但其根際細菌數量卻低于高積累型蕹菜。本研究關于細菌數量結果與蕹菜不完全一致,這可能是由于不同植物種類根際效應不同,對重金屬的吸收、耐受性以及對根際化學環境的敏感程度不同。

根際微生物菌群多樣性指數也表現出濟麥22明顯高于冀5265,表明低積累型小麥根際微生物群落在物種豐富度和優勢度上存在明顯優勢。16S rDNA序列分析表明,污染土壤中兩種小麥品種根際優勢細菌群落組成也存在較多品種間差異。這些結果均表明兩種不同積累型小麥品種根際微生物菌群多樣性和組成存在差異,這與Zhu等[25]利用磷脂脂肪酸技術分析發現7種雜交水稻品種根際特異性微生物群落存在差異結果相一致。同一土壤中高低積累型小麥根際微生物代謝活性、多樣性、組成及數量等差異可能與植物根系分泌物有關[26]。根系分泌物為微生物生長提供重要的營養來源,對根際定殖微生物種類具有選擇作用。不同生態型植物及重金屬脅迫使根系分泌物組成和數量會存在差異[27—28],這種差異會吸引不同的根際微生物聚集于植物根際[29-31]。根系分泌物-微生物-重金屬三者間存在復雜的相互作用關系。

通過對可培養優勢菌群16S rDNA序列分析,發現污染土壤中濟麥22與冀5265根際優勢菌物種差異較大,主要表現為濟麥22以放線菌門的Arthrobacter和厚璧菌門Bacillus為主,冀5265根際優勢菌以放線菌門Streptomyces為主,但非污染土壤中二者差異較小。根際微生物對植物根際環境變化較為敏感,在特定的脅迫環境中植物會招募能夠緩解植物自身脅迫壓力的特定微生物種群聚集于根際[32—33]。本研究發現在遭受重金屬脅迫后兩種小麥根際優勢菌群分別發生改變,但都以放線菌門為主,這與邵宗圓等[34]研究相一致。Arthrobactersp.能吸附重金屬,減少環境中重金屬生物有效性[35]。Bacillussp.能提高小麥抗氧化防御系統,減輕重金屬脅迫產生的氧化損傷[36],并能減少植物對重金屬的吸收積累[37]。Ali 等[10]發現接種Streptomycessp.能增強小麥對重金屬的吸收積累。Arthrobacter[38—39],Bacillus[40—41],Streptomyces[42]等菌都是重金屬污染土壤及耐性植物根際的優勢菌群,這些細菌對調節植物耐受重金屬及吸收積累重金屬具有重要作用。Bacillus和Streptomyces分別能通過產生內生芽孢和孢子增強對外界不良環境的耐受性。本研究中重金屬脅迫使兩種小麥分別招募這些特定的微生物類群,可能對幫助其應對重金屬脅迫具有重要作用。

3結論

(1)土壤污染脅迫促使不同積累型小麥根際抗性細菌數量及所占比例提高,低積累型濟麥22根際抗性細菌數量高于高積累型冀5265。

(2)土壤污染脅迫使小麥根際優勢菌群發生改變,濟麥22根際優勢菌以Arthrobactersp.和Bacillussp.為主,冀5265以Streptomycessp.為主,而非污染土中兩者根際優勢菌群較相似。

(3)低積累型小麥在污染土壤脅迫下根際會聚集大量產脲酶細菌和重金屬抗性細菌,可能與小麥低量吸收積累重金屬及其耐受性有關。

(4)兩種不同積累型小麥品種的根際微生物群落功能多樣性存在顯著差異,低積累型小麥的根際微生物代謝活性較強。