固體飲料中一種新型卡巴地那非類似物的定性鑒別和定量分析

夏金濤，吳婉琴，朱松松，江 豐*，范志勇，王會霞，彭青枝，楊 總

（1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；2.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 200335）

隨著社會的快速發(fā)展，人們工作生活壓力的加大，勃起功能障礙（Erectile dysfunction，ED）成為當前發(fā)病率較高的疾病之一，從而使得抗ED 藥物有著極大的市場需求。以西地那非為代表的選擇性5型磷酸二酯酶抑制劑作為治療男性抗ED 的特效藥之一，在食品、保健食品中的非法添加時有報道［1-9］。對那非及其衍生物母核不同位置的取代基進行修飾改造，可得到數(shù)量眾多的化學(xué)品［10-11］。這些未經(jīng)《藥品生產(chǎn)監(jiān)督管理方法》［12］（GMP）認證的結(jié)構(gòu)類似物，若被摻入到食品、保健食品或中成藥中，可能會對患者的健康和生命造成嚴重威脅。因此，建立多技術(shù)聯(lián)用手段對新型、非法添加、結(jié)構(gòu)未知的那非類似物進行定性鑒定和定量分析，對于保障廣大民眾“舌尖上的安全”具有重要意義。

目前，國家監(jiān)管部門發(fā)布的那非類物質(zhì)檢驗方法共有8 項［10-11，13］，檢測方法大多采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，涵蓋100 多種那非衍生物。但一些不法商家為了規(guī)避執(zhí)法人員的檢查，嘗試向保健食品中非法添加具有相似藥效、檢測標準以外的類似物，從中牟取暴利。近年來，丙氧苯基硫代艾地那非［8］、丙氧苯基西地那非［14］、丙氧苯基硫代羥基豪莫地那非［15］等新型那非衍生物被發(fā)現(xiàn)非法添加到食品及保健食品中。基于現(xiàn)行標準的局限性和被動性以及當前非法添加物篩查的需求，建立一種檢測食品中非法添加新型那非類物質(zhì)的通用、可行的技術(shù)手段顯得十分有必要。

本研究運用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）、超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-LTQ/Orbitrap MS）、核磁共振一維氫譜、碳譜和二維相關(guān)譜對固體飲料中非法添加那非類似物進行定性解析，最終確定該物質(zhì)為N-苯基丙氧苯基卡巴地那非，并采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）進行定量分析。本方法通過多技術(shù)聯(lián)用對新型非法添加卡巴地那非類似物進行了快速定性定量分析，為非法添加物質(zhì)的篩查提供了必要的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料與儀器

氘代二甲亞砜（DMSO - D6，D：99%）、氘代氯仿（CDCl3，D：98%）（Sigma - Aldrich 貿(mào)易有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國Fisher Scientific 公司）；乙酸銨（色譜純，F(xiàn)isher Chemical 公司）；超純水（美國Millipore 公司）；其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑公司；柱層析硅膠（300 ～400 目，青島海洋化工廠分廠）；薄層層析硅膠板（Silica gel 60 F254，德國Merck公司）；5 mm核磁管（美國Norell公司）；咖啡空白基質(zhì)及固體飲料：電商平臺。

液相色譜（Dionex Ultimate 3000）- 四極桿- 飛行時間質(zhì)譜儀（SCIEX Triple TOF 5600 +）（美國SCIEX公司）；Ultimate 3000高效液相色譜儀（配備二元泵、柱溫箱、自動進樣器）、線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo 公司）；Bruker Avance III HD 600 MHz 超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（配備Waters 2998 光電二極管陣列檢測器，美國Waters 公司）；AB Sciex Qtrap 6500 型串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國SCIEX 公司）；HEI-VAP 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph GmbH）；Dryfast 2045 真空泵（德國Welch 公司）；ZF-20D 暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；230 Volt 渦旋振蕩器（美國Talboys 公司）；S 180H 超聲波清洗儀（德國艾爾瑪公司）；Centrifuge5810常溫低速離心機（德國Eppendorf公司）；XS204 電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 定性分析條件

1.2.1 色譜條件TOF MS 色譜條件：色譜柱：Accucore aQ（150 mm × 2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；流速：300 μL/min；進樣量：5 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，95% A；2.0～20.0 min，95%～5% A；20.0～25.0 min，5% A；25.0～26.0 min，5%～95%A；26.0～30.0 min，95%A。

Orbitrap MS色譜條件：色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相：A為乙腈，B 為水（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，1%A；3.0～5.0 min，1%～95%A；5.0～7.0 min，95%A；7.0～7.5 min，95%～1%A；7.5～10 min，1%A。流速：300 μL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件TOF MS 條件：離子源：電噴霧離子源（ESI 源）；掃描方式：正離子模式；電噴霧電壓（IS）：5 500 V；氣簾氣壓力（CUR）：241 325 Pa；霧化氣壓力（GS1）：241 325 Pa；輔助氣壓力（GS2）：241 325 Pa；離子源溫度（TEM）：500 ℃；全掃描一級質(zhì)譜（MS），質(zhì)量采集范圍100 ～1 000 Da；全掃描二級質(zhì)譜（MS/MS），質(zhì)量采集范圍50 ～1 000 Da。

Orbitrap MS條件：離子源溫度：325 ℃；離子傳輸桿溫度：350 ℃；鞘氣壓力：275 800 Pa；輔助氣壓力：68 950 Pa；掃描模式：Full-scan ddMS3，一級優(yōu)先掃描目標母離子m/z515.276 7，二級優(yōu)先掃描目標子離子m/z161.107 3；一級掃描高能碰撞裂解（HCD）碎裂能量：40 eV，二級掃描HCD 碎裂能量：60 eV；一級掃描分辨率：R=60 000，二級掃描分辨率：R=30 000；一級掃描自動增益控制目標離子數(shù)（AGC）：100 000，二級掃描自動增益控制目標離子數(shù)（AGC）：10 000；質(zhì)量偏差窗口：10 ppm。

1.2.3 核磁條件1H NMR 脈沖序列：zg30，采樣次數(shù)（NS）：4，譜寬（SW）：20 ppm，觀察道中心頻率偏置（O1P）：6.175 ppm；13C NMR脈沖序列：zgpg30，NS：500，SW：240 ppm，O1P：100 ppm。

1.2.4 液相色譜純度測試條件色譜柱：C18色譜柱（250 mm ×2.1 mm，5.0 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A 為甲醇，B 為0.02 mol/L 乙酸銨水溶液，采用二元等度洗脫（70%A、30%B），檢測波長：230 nm。

1.3 HPLC-MS/MS定量分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：C18色譜柱（2.1 mm×75 mm，2.1 μm）；柱溫：35 ℃；流速：300 μL/min；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.0 min，95%A；1.0～4.0 min，95%～5%A；4.0～7.0 min，5%A；7.0～7.1 min，5%～95%A；7.1～10.0 min，95%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI 源；檢測方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；掃描方式：正離子模式；IS：5 500 V；CUR：310 275 Pa；GS1：241 325 Pa；GS2：241 325 Pa；TEM：500 ℃。

1.4 樣品前處理

1.4.1 待測樣品制備稱取1 g（精確至0.001 g）待測樣品置于50 mL 容量瓶中，加甲醇適量，渦旋振蕩2 min 后，超聲輔助提取10～15 min，冷卻至室溫，用甲醇定容，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，3 900 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機微孔濾膜。取續(xù)濾液，樣品定性可直接上機測試，樣品定量則根據(jù)實際濃度用甲醇水溶液（1∶1）稀釋至線性范圍內(nèi)，備用。

1.4.2 核磁純樣制備稱取約36.0 g 樣品于500 mL 圓底燒瓶中，分3 次加入300 mL 甲醇，樣品每次經(jīng)渦旋振蕩10 min，超聲輔助提取10 min 后，抽濾。下層液體經(jīng)旋蒸儀旋干后，通過快速柱層析硅膠對提取物進行凈化，用暗箱式紫外分析儀對薄層層析硅膠板爬板結(jié)果進行初步判斷，收集產(chǎn)品進行富集，旋干溶劑，用真空泵將樣品抽干。取約10 mg 粉末，以DMSO-D6或CDCl3為溶劑，終產(chǎn)品進行核磁一維和二維譜測試。

1.5 標準溶液配制

1.5.1 標準儲備液精密稱取N-苯基丙氧苯基卡巴地那非10 mg，用甲醇溶解并稀釋至50 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標準儲備液。于-20 ℃避光貯存，有效期為3個月。

1.5.2 標準工作液準確吸取標準儲備液適量，用甲醇水溶液（1∶1）稀釋，搖勻，作為系列標準工作液，質(zhì)量濃度依次為2、5、10、20、50 ng/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析

2.1.1 目標化合物的一級分子量掃描、二級及三級質(zhì)譜裂解分析取待測樣品，按照“1.2.1”的TOF MS 色譜條件進行分離，發(fā)現(xiàn)該化合物的保留時間為15.41 min（圖1A），隨后按“1.2.2”的TOF MS 質(zhì)譜條件直接進樣進行一級分子量掃描，得到準分子離子峰為m/z515.276 7（［M+H］+），經(jīng)擬合后確定化合物的分子式為C29H34N6O3（質(zhì)量偏差0.4 ppm）（圖1B）。進一步以m/z515.276 7為母離子進行子離子掃描，得到二級碎片質(zhì)譜圖（圖2A），該化合物具有明顯的西地那非特征離子m/z311.113 0、283.118 3、166.097 0、147.007 7，說明其至少具有圖2A的母核結(jié)構(gòu)。由二級碎片離子m/z353.159 0可推測，從m/z353.159 0到311.113 0丟失了C3H7，但不能確定C3H7在化合物中的連接方式。從m/z515.275 1到353.159 0可能丟失了C10H13N2，為進一步確定其基本結(jié)構(gòu)，按“1.2.1”和“1.2.2”，采用UPLC-LTQ/OrbitrapMS對其進行了三級碎裂（圖2B）。可見此部分具有明顯的苯環(huán)（m/z77.038 43）、丟失1 個亞甲基或氮原子（m/z146.083 82）的結(jié)構(gòu)。

圖2 目標化合物的二級碎片質(zhì)譜圖、母核結(jié)構(gòu)（A）及三級碎片質(zhì)譜圖（B）Fig.2 Secondary fragment MS spectrum，parent nucleus（A）and third fragment MS spectrum（B）of desired product

2.1.2 目標化合物的核磁譜圖分析取“1.4.2”的純化樣品約10 mg，以DMSO - D6為溶劑，按“1.2.3”條件測試樣品的氫譜（圖3A）和碳譜（圖3B），得到相關(guān)數(shù)據(jù)如下：1H NMR（600 MHz，DMSO）δ12.01（s，1H），7.74（d，J=2.2 Hz，1H），7.59（dd，J=8.5，2.2 Hz，1H），7.26 ～7.19（m，3H），6.95（d，J=8.1 Hz，2H），6.8（t，J=7.2 Hz，1H），4.15（s，3H），4.08（t，J=6.3 Hz，2H），3.67（brs，4H），3.34（s，3H），3.18（brs，4H），2.76（t，J=7.5 Hz，2H），1.78 ～1.6（m，4H），0.96（t，J= 7.4 Hz，3H），0.91（t，J= 7.4 Hz，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO）δ168.8，158.0，154.1，151.3， 149.3， 145.4， 138.4， 131.5， 130.3， 129.4， 127.9， 124.7， 123.1， 119.9， 116.4，113.0，70.5，49.0（overlapping），38.3，27.7，22.4，22.2，14.3，10.9。

圖3 目標化合物的1H NMR譜（A）和13C NMR譜（B）Fig.3 1H NMR（A）and13C NMR（B）spectra of desired product

通過1H NMR 觀察到氫原子總數(shù)為34 個，與“2.1.1”質(zhì)譜分析所得分子式（C29H34N6O3）結(jié)果一致；通過脂肪區(qū)氫原子的裂分形式4.08（t，J= 6.3 Hz，2H）ppm，1.78 ～1.68（m，4H）ppm，0.96（t，J=7.4 Hz，3H）ppm 可以確證圖2中R1為正丙基，且有1個亞甲基信號與吡唑環(huán)上丙基的亞甲基信號重疊。二維TOCSY核磁譜顯示芳香區(qū)的氫原子屬于同一自旋體系，結(jié)合13C NMR 129.4 ppm，116.4 ppm 推測該自旋體系為1 個三取代和1 個單取代苯環(huán)，根據(jù)芳香區(qū)氫原子的數(shù)目確定圖2 中R2含有單取代苯環(huán)。根據(jù)13C NMR 168.8 ppm，判斷三取代苯環(huán)上連有酰胺鍵。脂肪區(qū)的化學(xué)位移3.67（brs，4H），3.18（brs，4H）ppm 說明R2含有2 對對稱的亞甲基結(jié)構(gòu)。結(jié)合文獻［16］比對，確定該化合物為N-苯基丙氧苯基卡巴地那非（圖4），該結(jié)構(gòu)與1H NMR、13C NMR 及Dept-90/135-13C分析高度吻合。氫譜、碳譜歸屬如表1。

圖4 N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of N-phenylpropoxyphenyl carbodenafil

表1 N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的核磁共振數(shù)據(jù)歸屬（DMSO-D6）Table 1 NMR data of N-phenylpropoxyphenyl carbodenafil（DMSO-D6）

根據(jù)確認的結(jié)構(gòu)，結(jié)合質(zhì)譜分析，歸納整個分子的裂解途徑如圖5所示。在溶液中N-苯基丙氧苯基卡巴地那非（分子式C29H34N6O3，分子量514.269 2）以游離態(tài)形式存在，正離子模式下，m/z為515.276 7。初次裂解得到m/z為353.160 8 和161.107 3 的特征碎片離子峰，隨后2 個特征碎片峰分別發(fā)生進一步裂解。其中m/z為353.160 8 的碎片離子在高電壓下發(fā)生正丙基斷裂，得到m/z為283.119 0 的碎片峰，隨后進一步脫羰基得到m/z為255.124 0 的碎片離子。m/z為161.107 3 的碎片經(jīng)Orbitrap 三級裂解分析，分別得到m/z146.096 4 和77.038 6的特征離子峰。

圖5 N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 MS fragment pathway of N-phenylpropoxyphenyl carbodenafil

2.2 定量分析

2.2.1 目標化合物的純度評價取待測樣品，按“1.2.4”條件測得目標化合物N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的最大吸收波長為204 nm，純度為99.78%。

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng)采用相對響應(yīng)值法對咖啡基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)（ME）進行考察，計算公式如下：ME =（k2/k1-1）×100%。式中：k1為標準溶液曲線的斜率；k2為基質(zhì)標準曲線的斜率。一般來說，當基質(zhì)效應(yīng)為-20%～20%時，表明基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)；反之則應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)對實際檢測的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，咖啡空白基質(zhì)在原液配制標準曲線中存在一定基質(zhì)效應(yīng)，而采用甲醇水溶液（1∶1）稀釋10倍的空白基質(zhì)原液配制標準曲線，基質(zhì)效應(yīng)有所減弱，進一步采用甲醇水溶液（1∶1）稀釋100 倍的空白基質(zhì)原液配制標準曲線，基質(zhì)效應(yīng)均在-20%～20%之間。因此，本實驗中陽性樣品基質(zhì)在前處理中增加稀釋過程，以降低或消除基質(zhì)效應(yīng)，并采用空白溶劑標準曲線進行定量。

2.2.3 線性關(guān)系、檢出限與定量下限取“1.5.2”制備的標準工作液，按照“1.4.1”和“1.3”方法進行前處理及測定，采用外標法定量。以目標化合物的峰面積為縱坐標（y），質(zhì)量濃度為橫坐標（x）制作標準曲線，得到目標化合物在2～50 ng/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=358 084x-695 617，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 1。通過測定不同加標水平的樣品溶液，以3 倍信噪比確定方法檢出限（LOD），以10 倍信噪比確定方法定量下限（LOQ），并綜合考慮與補充檢驗方法BJS201805［13］的一致性，得到咖啡樣品中N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的LOD 為0.05 mg/kg，LOQ 為0.1 mg/kg。

2.2.4 回收率與相對標準偏差對咖啡空白基質(zhì)樣品進行三水平加標回收率實驗，分別制成加標水平為0.1、0.2、1.0 mg/kg 的樣品，每個濃度做6 次平行實驗，考察方法的回收率和相對標準偏差（RSD）。得到不同加標水平下的平均回收率為89.2%～93.1%，RSD 為1.8%～3.1%，可以滿足分析要求。

2.3 實際樣品的測定

采用本方法對電商平臺購買的10批次固體飲料進行測定。結(jié)果表明，有5批次樣品檢出N-苯基丙氧苯基卡巴地那非，檢出含量分別為214、218、229、268、880 mg/kg。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振表征的多檢測技術(shù)手段鑒定固體飲料中新型、非法添加、結(jié)構(gòu)未知的卡巴地那非類似物—N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的方法。該化合物目前無CAS 號登記，其毒理數(shù)據(jù)也未見報道。HPLC-MS/MS定量分析表明，N-苯基丙氧苯基卡巴地那非的線性范圍為2～50 ng/mL，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 1，方法的平均回收率為89.2%～93.1%，RSD 為1.8%～3.1%。對市場上10批次咖啡固體飲料進行檢測，發(fā)現(xiàn)5批次樣品檢出該非法添加物，含量為214～880 mg/kg，說明該物質(zhì)在固體飲料中的非法添加存在潛在的安全隱患。