黑葉猴腸道纖維素降解菌篩選鑒定及對雞飼料粗纖維降解效率的影響

龐美玲 周心意 陸祖軍

摘 要 利用選擇性培養基篩選獲得目標菌株，并鑒定其分類屬性;采用單因素試驗設計，篩選最適產酶條件;再將該菌株作為飼料添加劑飼養雞群，探明其對雞飼料粗纖維降解效率及雞群體重的影響，旨在篩選黑葉猴（Trachypithecus francoisi）腸道高效纖維素降解菌，為人體腸道益生菌群或畜牧業飼料添加劑擴大菌譜。結果：鑒定出黑葉猴腸道的纖維素降解菌株為芽孢桿菌屬的一種（Bacillus sp.），并命名為GXNQ-1;其最適產酶條件為：溫度40 ℃，pH值6，培養時間為24 h，底物濃度（CMC-Na）為0.94%，此時該菌株酶活力值達48 U;在40日齡前每隔10日給雞群灌服500 μL（OD540=0.86）的試驗菌液取得明顯的增重效果。

關鍵詞 黑葉猴;纖維素降解菌;酶學特征;粗纖維消化率;雞群體重

中圖分類號：S816.3 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.07.001

纖維素是地球上最豐富的可再生資源之一，但動物腸道內很少有相應的降解酶能將其降解為單體葡萄糖，只有少部分真菌和細菌能產生相應降解酶將其降解利用[1]。

酶解和微生物降解使纖維素轉變為葡萄糖分子，是纖維素開發利用的基礎和前提[1]。王安以纖維素復合酶作為青貯添加劑，提高了玉米秸稈飼用價值，為纖維素復合酶在飼料中合理利用提供依據[2]。施力光等揭示了纖維分解菌在反芻動物營養代謝中的重要作用[3]。劉幼強以甘蔗渣為唯一碳源，篩選出可高效分解甘蔗渣的復合菌群并應用于固態發酵，實現了以甘蔗渣為原料生產燃料酒精的目標[4]。李旺等在雞飼料中添加可產生纖維素降解酶的菌株，顯示其有助于粗纖維的消化、轉化[5]。

黑葉猴（Trachypithecus francoisi）屬于國家一級保護動物，主要分布于廣西、云南、貴州部分喀斯特地區，以葉食性為主[7]。根據適應進化學說，黑葉猴體內（腸道）微生物應該存在適應其生存環境（食物）的相應菌群，且有可能進化成具有特異功能的菌群，如高效降解利用纖維素的菌株，但目前尚無相關研究報道。靈長類動物與人類親緣關系近，遺傳背景相似，挖掘并開發利用該猴腸道內具有降解纖維素的微生物，是對人體腸道纖維素降解菌篩選、畜牧業飼料添加劑菌譜擴大、珍稀瀕危動物保護與利用的一種有益嘗試。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?菌株

2019年11月于廣西梧州黑葉猴保護基地隨機采集黑葉猴新鮮糞便。利用已滅菌采樣棒采集排放到地面上不足5 min的新鮮黑葉猴糞便內里部分，并迅速放入已備好的滅菌采樣管中，放入實驗室-4 ℃冰箱內儲藏，12 h內分離純化目標菌株。

1.1.2 ?培養基

1.1.2.1 ? ?富集培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：蛋白胨8 g，牛肉膏4 g，可溶性淀粉1.6 g，NaCl 4 g，瓊脂16 g，蒸餾水800 mL，pH值為7。

1.1.2.2 ? ?分離篩選培養基

1）CMC-Na固體培養基：K2HPO4 0.25 g，MgSO4 0.125 g，瓊脂10 g，羧甲基纖維素鈉0.94 g，NH4NO3 0.3 g，剛果紅0.1 g，蒸餾水500 mL，pH值為7。

2）CMC-Na液體培養基：在CMC-Na固體培養基基礎上減除10 g瓊脂，其余同。

1.1.3 ?試劑

1 mol·L-1的鹽酸溶液（AR，上海尚寶生物科技有限公司，下同），1%氫氧化鈉溶液，DNS試劑，1 mg·mL-1葡萄糖溶液，1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液，1 g·L-1剛果紅溶液，30%甘油溶液。

1.1.4 ?飼料

飼養雞的飼料購自南寧漓江源糧油飼料有限公司，生產廠家標注的主要成分如表1所示;委托青島正信檢測公司對該飼料進行粗纖維素含量測定，得到其粗纖維素含量為6.7%。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?纖維素降解菌株的分離、篩選

1.2.1.1 ? ?糞便懸液和梯度稀釋液制備、涂布和富集

稱取相當于1.0 g干燥糞便的新鮮糞便（120 ℃加熱至恒重時含水量為84.8%）樣品1.17 g溶于99 mL生理鹽水中，充分振蕩20 min，使糞便樣品中的細菌分散，制成糞便懸液。參照文獻[8]制成0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的糞便溶液。取各梯度稀釋菌懸液0.2 mL，用無菌涂布器均勻涂布牛肉膏蛋白胨培養基平板，36 ℃倒置培養48 h分離單菌落。每個梯度設置3個重復，共21個平板。

1.2.1.2 ? ?目標菌株分離、培養和保存

將牛肉膏蛋白胨培養基平板形成的所有單菌落用牙簽點接于CMC-Na固體培養基平板上，設置3個重復。培養皿封口后37 ℃倒置培養96 h，將有透明圈的菌落同時分別移接2套CMC-Na固體培養基平板（網格化點接標記），培養皿封口后再37 ℃倒置培養96 h。以每皿 1 mL剛果紅溶液（1 g·L-1）對其中1套CMC-Na固體培養基平板染色，20 min后，緩慢傾棄剛果紅溶液。從另一套CMC-Na固體培養基平板上選取剛果紅溶液染色后透明圈最大的菌落為目標菌株。挑取目標菌株于液體培養基內37 ℃培養8 h，以30%甘油和菌液等體積混合并參照文獻[8]進行菌種保藏。

1.2.2 ?目標菌株的鑒定

在觀察菌落形態、顏色、質地基礎上，以革蘭氏染色法初步確定菌株的微生物類別[8];以16S rDNA擴增子測序方法進行菌株的分子鑒定[9]。CTAB抽提法提取目標菌種基因組后，以引物（7F：5′-CAGAGTTT GATCCTGGCT-3′;1540R：5′-AGGAGGTGATCCAG CCGCA-3′）PCR擴增（退火溫度：55 ℃）及電泳檢定擴增片段的單一性及長度（1 500 bp左右）。將PCR單一片段產物直接送上海生工公司測序。測序結果于NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLASTN比對，同時利用軟件（MEGA7）構建系統發育進化樹，確定目標菌株的分類屬性。3B36E9D2-FCB4-4A94-84CC-AB2374FBC5B7

1.2.3 ?胞外纖維素酶活性測定

參照文獻[10]進行酶活性測定。酶活力單位（U）規定為每分鐘水解CMC-Na產生1 μg葡萄糖所需酶量。

1.2.3.1 ? ?溫度對酶活性的影響

將37 ℃培養24 h的目標菌株菌液置于不同溫度中進行培養，探究不同溫度對產生的胞外纖維素酶酶活性的影響[9]。具體為4 ℃、轉速6 000 r·min-1條件下離心3 min后，取0.5 mL上清液（粗酶液）與1.5 mL CMC-Na溶液混合（冰上），另取0.5 mL無菌水與1.5 mL CMC-Na溶液混合作為對照（冰上）。分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下水浴加熱30 min，隨后立即加1.5 mL DNS試劑（顯示劑），并在100 ℃下水浴加熱10 min，取出后立即冰上冷卻，用無菌蒸餾水定容至25 mL，測定OD540吸光值并記錄。

1.2.3.2 ? ?pH值對酶活性的影響

將37 ℃培養24 h的目標菌株菌液置于不同pH的培養基中進行培養，探究不同pH對產生的胞外纖維素酶酶活性的影響[11]。具體為用1 mol·L-1鹽酸溶液、1%氫氧化鈉溶液將CMC-Na溶液的pH值分別調至2、4、6、8、10、12、14。取各pH值的CMC-Na溶液1.5 mL與0.5 mL粗酶液（目標菌液在4 ℃、轉速6 000 r·min-1條件下離心3 min后取上清液）混合（冰上），另取1.5 mL CMC-Na溶液與0.5 mL無菌水混合作為對照組（冰上）[9]。在最適溫度（通過1.2.3.1確定）下水浴加熱30 min，隨后立即加1.5 mL DNS試劑（顯示劑），并在100 ℃下水浴加熱10 min，取出后立即冷卻，用無菌蒸餾水定容至25 mL，測定OD540吸光值并記錄。

1.2.3.3 ? ?CMC-Na濃度對酶活性的影響

將CMC-Na作為唯一碳源制備成CMC-Na含量不同的液體培養基（CMC-Na含量不同，其余成分含量相同），CMC-Na含量分別是0.07%、0.13%、0.19%、0.25%、0.31%。分別加入1 mL的目標菌液（OD540=0.86），在最適溫度（通過1.2.3.1確定）、最適pH值（通過1.2.3.2確定）下搖床培養10 h，以粗酶液進行CMC-Na糖化力測定，明確CMC-Na底物濃度對胞外纖維素酶酶活性的影響[13]。

1.2.3.4 ? ?目標菌株培養時間對酶活性的影響

目標菌株在最佳CMC-Na濃度（通過1.2.3.3確定）、最適溫度（通過1.2.3.1確定）、最適pH值（通過1.2.3.2確定）培養基中培養不同時間，探究目標菌株培養時間對胞外纖維素酶酶活性的影響。將目標菌株接種于培養基中，共2瓶，編號為1、2。搖床培養條件下（37 ℃，120 r·min-1），每隔12 h隨機取出1瓶，在超凈工作臺上取1 mL菌液于已滅菌的離心管中（取完菌液后立即將已接菌的培養基放回搖床中繼續搖床培養），并測定胞外纖維素酶酶活性[14]。以培養時間（h）為橫坐標，酶活力（U）為縱坐標，確定菌株產出的胞外纖維素酶酶活性最高的培養時間。

1.2.4 ?市售肉雞飼料粗纖維制取

采用濾袋技術分離飼料中的粗纖維[12]。先將1 g肉雞飼料裝入濾袋（鹽城晨星環?？萍加邢薰旧a的2號袋，規格180 mm×810 mm）并進行酸堿消煮（先加入150 mol·L-1硫酸并煮沸20 min，脫水并用蒸餾水處理至中性，再脫水3 min;后加入150 mol·L-1 KOH并煮沸20 min，使用相同方法恢復中性并脫水），再用丙酮脫脂，120 ℃烘干至恒重、稱量。

1.2.5 ?應用試驗

試驗選用20日齡的黃羽肉雞，隨機分為4組，即1個對照組和3個處理組，每組10只。不同處理組每隔10日灌服不同劑量（灌服量分別為300、400、500 μL·只-1）的目標菌液（OD540=0.86），試驗周期為40 d;規定前20 d為前期，后20 d為后期。每飼養20 d，以全收糞法收集雞糞，測定各組雞糞中粗纖維含量，同時檢定飼養時段各組雞群的存活、體重增長情況（體重取每組雞群平均值）。通過比較灌服目標菌液前后雞糞中纖維素含量差別，確定前、后期最適灌服菌液劑量[12]。

1.3 ?數據處理

采用Excel 2017軟件對試驗數據進行處理分析，結果以“平均值±標準差”表示;P值<0.05表示差異顯著，P值<0.01表示差異極顯著。

粗纖維消化率參照文獻[15]計算。

粗纖維消化率=（采食量×飼料粗纖維含量-糞重×糞樣粗纖維含量）/（采食量×飼料粗纖維含量）×100%。

2 ?結果與分析

2.1 ?目標菌株的分離與鑒定

2.1.1 目標菌株的篩選與分離

在CMC-Na固體培養基上篩選到呈最大透明圈的菌落1個，其長勢較好，正面為淡黃色，中心隆起，邊緣整齊，命名為GXNQ-1;經革蘭氏染色后，呈紫色，可判定為革蘭氏陽性細菌。

2.1.2 ?GXNQ-1的16S rDNA擴增子測序鑒定

2.1.2.1 ? ?GXNQ-1的16S rDNA的PCR擴增

以提取的GXNQ-1基因組DNA為模板，利用細菌通用引物（7F、1540R）進行PCR擴增，取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1，單一擴增子長度約為1 500 bp的核苷酸片段，與預期相符。

2.1.2.2 ? ?GXNQ-1的16S rDNA擴增子序列及系統發育進化樹3B36E9D2-FCB4-4A94-84CC-AB2374FBC5B7

將GXNQ-1的16S rDNA擴增片段送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，顯示擴增子序列長度為1 490 bp（核苷酸序列登錄號為SUB10687086 GXNQ-1OL545364）。將該核苷酸序列與NCBI網站上的GenBank基因序列進行在線BLAST，發現其與Bacillus sp.同源性達100%。同時利用軟件（MEGA7）對GXNQ-1的16S rDNA擴增子序列和相近物種者在線構建系統發育進化樹，結果如圖2。結合該菌的形態特征與培養特性，鑒定該菌為芽孢桿菌屬的一種（Bacillus sp.）。

2.2 ?胞外纖維素酶酶活性測定結果

GXNQ-1胞外纖維素酶酶活性測定所用曲線的回歸方程為y=0.987 5x-0.015 1（R2=0.999 1），說明曲線擬合程度較好，具有可信度。

2.2.1 ?GXNQ-1胞外纖維素酶酶活性最適溫度

由圖3可知，GXNQ-1菌所產的胞外纖維素酶酶活性最適反應溫度為40 ℃，此時酶活力高達97.42 U;在20～40 ℃時，其酶活力隨溫度升高而升高，但高于40 ℃時，酶活力隨溫度升高而降低。

2.2.2 ?GXNQ-1胞外纖維素酶酶活性最適pH值

由圖4可知，GXNQ-1胞外纖維素酶酶活性最適pH值為6，此時酶活力高達184.51 U;在pH值2～6時，其酶活力隨pH升高而升高，但pH值超過6以后，其酶活力隨pH升高而降低。

2.2.3 ?CMC-Na濃度對GXNQ-1胞外纖維素酶酶活性的影響

從圖5可以看出，GXNQ-1菌在CMC-Na質量分數為0.19%的培養基中產生的胞外纖維素酶酶活力最高，達46.79 U。

2.2.4 ?培養時間對GXNQ-1菌株胞外纖維素酶酶活性的影響

由圖6可知，培養時間為24 h時的GXNQ-1菌所產胞外纖維素酶酶活力最高，達48.81 U;培養時間超過24 h后，其所產胞外纖維素酶酶活力下降。

2.3 ?雞群灌服GXNQ-1菌液對其所食用飼料粗纖維降解效果的影響

2.3.1 飼養前期雞群灌服GXNQ-1菌液對粗纖維素降

解效果的影響

飼養前期雛雞群灌服GXNQ-1菌液對粗纖維素降解效果的影響如表2所示。灌服GXNQ-1菌液的3個處理組（灌服量分別為300、400、500 μL·只-1）對粗纖維的消化率都顯著高于對照組（提高10%以上）（P<0.05），但是3個處理組之間差異不顯著（P>0.05）。

2.3.2 ?飼養后期雞群灌服GXNQ-1菌液對粗纖維降解的影響

飼養后期雞群灌服GXNQ-1菌液對粗纖維降解的影響如表3所示。灌服GXNQ-1菌液的3個處理組對粗纖維的消化率與對照組之間差異不顯著（P>0.05），表明飼養后期雞群灌服GXNQ-1菌液對粗纖維降解無顯著影響。

2.3.3 ?灌服GXNQ-1菌液對雞群體重的影響

試驗雞群只有對照組中有1只雞于飼養第10日死亡。飼養至20 d、40 d時（40日齡、60日齡），記錄雞群體重變化，結果如圖7～圖9所示。

結果表明，當每只雞灌服GXNQ-1菌液為300 μL、400 μL時，無論是飼養前期還是后期，處理組和對照組無顯著差異;當灌服量為500 μL·只-1時，飼養40 d（60日齡）的雞群體重較對照增加了33.4%。

3 ?小結與討論

3.1 ?纖維素降解菌的篩選

纖維素降解菌的篩選方法主要有纖維素剛果紅培養基法、纖維素選擇培養基法、半固體纖維素天青試管法、濾紙底物法等，其中纖維素剛果紅培養基法應用得較多[5]。纖維素降解菌在纖維素剛果紅培養基上培養一段時間后可產生透明圈，以透明圈直徑大小判定菌株纖維素降解能力的強弱。透明圈出現的主要原因在于纖維素降解菌將菌株周圍的纖維素分解成葡萄糖，葡萄糖不與剛果紅形成紅色復合物，但纖維素與剛果紅可形成紅色復合物，故出現以纖維素降解菌為中心的透明圈。由于纖維素剛果紅培養基法呈現的結果明顯，且易操作，目前普遍認為這是初步篩選纖維素分解菌的較好方法[5]。基于此，本試驗采用纖維素剛果紅培養基法檢定黑葉猴腸道高效降解纖維素的GXNQ-1菌株。

經過菌株形態判定、革蘭氏染色鑒定，初步鑒定GXNQ-1菌為革蘭氏陽性細菌。通過目前常用的16S rDNA擴增子測序后進行序列同源性比對、構建系統進化樹，從而確定細菌種屬。周新萍等從朽木中篩選、分離到1株高產纖維素酶的NC-7菌株，經形態觀察和生理生化試驗，再以16S rDNA擴增子測序后序列同源性比對，確定該菌株為放線菌鏈霉菌屬生二素鏈霉菌（Streptomyces ambofaciens）[16]。本試驗采用16S rDNA擴增子測序方法鑒定出黑葉猴腸道的纖維素降解菌株為芽孢桿菌屬的一種（Bacillus sp.），并命名為GXNQ-1。

3.2 ?纖維素降解菌GXNQ-1的產酶條件優化

菌株不同，其最適產酶條件也有所差異。如何優化產酶條件，是菌株應用于生產實踐的關鍵環節。錢文佳等優化了纖維素降解菌的產酶條件，進一步提高了該菌株纖維素酶的活性[17]。GXNQ-1分解利用纖維素的最佳條件為：溫度40 ℃，pH值為6，培養時間24 h，培養基中的CMC-Na含量為0.19%，此條件下的酶活性達48 U。此條件溫和，生產實踐中易實現，說明本研究篩選到的菌株具有一定的應用價值。

3.3 ?纖維素降解菌GXNQ-1的應用試驗

李旺等在雞飼料中添加可產生纖維素降解酶的菌株，顯示其有助于粗纖維的消化、轉化[5]。孫元烽等從不同畜糞及三種商品微生物堆肥劑中篩選高效纖維素降解菌并在羊糞堆肥中初步應用，發現該菌能夠有效提升纖維素降解效果[6]。王安等在蛋雞日糧中加入纖維素酶，結果較大地提高了日糧纖維素消化率，說明雞日糧中添加纖維素酶可有效提升纖維素降解效果，從而提高飼料粗纖維的消化率[3]。3B36E9D2-FCB4-4A94-84CC-AB2374FBC5B7

有學者以20日齡雛雞為試驗對象，發現其肝臟和消化道遠未發育完全，腸道內微生物形成的微生態系統未達到穩定階段[18]。房興堂等通過對1～7周齡肉雞的消化器官重量及消化道各部分長度進行測量，結果表明消化器官的變化隨體重同步變化[19]。程郁昕等以AA肉雞商品為試驗材料，測量不同肉雞的消化道各部分長度，得出消化道的生長勢在28日齡以前最強[20]。

將GXNQ-1菌液作為飼料添加劑飼養雞群的試驗表明，飼養前期（前20 d，日齡20～40 d）灌服試驗菌液使雞群對纖維素的分解效率顯著增加，但不同的灌服劑量（300 μL·只-1、 400 μL·只-1、500 μL·只-1）對纖維素的消化率并無顯著差異;飼養后期（后20 d，日齡40～60 d），灌服GXNQ-1菌液對雞的粗纖維素消化率無顯著影響，僅有灌服菌液（500 μL·只-1）飼養40 d（日齡60 d）的雞群體重較對照增加了33.4%;這顯然是菌液改善了飼養前期雛雞的營養供給（纖維素降解效率提高15.48%左右）所致，因為4周齡前是雛雞消化器官（肝臟和消化道等）生長旺盛階段[19]。

本試驗通過給雞群灌服GXNQ-1菌液，能較快地在飼養前期的雞群腸道內建立以GXNQ-1為優勢菌群的新微生態平衡，提高纖維素的降解效率，改善試驗條件下的養分供給，提高試驗組雞群的代謝效率，使其體重快速增加。飼養后期的雞群肝臟和消化道發育較完全，腸道內微生物形成的微生態系統接近穩定狀態，使GXNQ-1難以成為優勢菌群從而提高飼料中粗纖維的降解效率，使試驗組雞群體重沒法快速增加，但由于有飼養前期的代謝效率優勢作基礎，處理組雞群在試驗時間結束時仍有體重較對照組增加33.4%的明顯效果。因此，以GXNQ-1菌株作為飼料添加劑飼養肉雞時，40日齡前每隔10日灌服500 μL（OD540=0.86）的目標菌液將取得明顯的增重效果。

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（責任編輯：易 ?婧）

收稿日期：2021-12-15

基金項目：2020年廣西壯族自治區大學生創新創業訓練計劃項目“黑葉猴高效纖維降解菌的飼料降解效率研究”（202010602055）。

作者簡介：龐美玲（1997—），女，廣西玉林人，廣西大學林學專業2021級在讀碩士研究生，主要研究方向為森林保護學。E-mail： 2919341698@qq.com。

*為通信作者，E-mail： luzujun2002@aliyun.com。3B36E9D2-FCB4-4A94-84CC-AB2374FBC5B7